中国劳动经济学稿件信息
桢楠叶枯病原与相关生理响应研究
朱涵明月，曾健强，谯天敏
(四川农业大学风景园林学院 四川成都 611130)
摘 要
本文从成都温江绿道景区盆栽的桢楠苗上采集叶枯病叶片样本，进行病原菌分离鉴定，研究了病原菌对桢楠叶片生理生化的影响。结果表明，在感病桢楠叶片中分离，得到1种优势分离物，通过柯赫氏法则验证，回接植株叶片症状与自然发病一致，采用态学特征结合rNDA-ITS序列分析确定该病原菌为半知菌纲链孢霉目黑霉科的细极链格孢[Alternaria tenuissima(Fr.)]。在健康桢楠叶片上接种细极链格孢，对感病叶片丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性进行持续测定，细极链格孢的侵染使桢楠叶片丙二醛(MDA)的含量上升，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性均低于对照，桢楠不同代谢指标对病菌侵染反应有差异。
关键词：桢楠；细极链格孢；叶枯病；生理响应
Study on Leaf blight of Phoebe zhennan and Its Physiological Reaction
Abstract
In this paper, leaf blight samples were collected from the seedlings of Phoebe zhennan in the Wenjiang Greenway Scenic Spot in Chengdu, and the pathogens were isolated and identified. The effects of pathogenic bacteria on the physiological and biochemical characteristics of P. zhennan were studied. The results showed that one dominant separation was isolated from the leaves of susceptible P. zhennan. The Koch’s Postulates confirmed that the leaf symptoms of the grafted plants were consistent with the natural pathogenesis. According to the identification of state characteristics and rNDA-ITS sequence analysis, the result showed that the pathogenic bacteria is Deuteromycetes, Moniliales, Dematiaceae, Alternaria tenuissima (Fr.). Inoculating A. tenuissima on healthy leaves, gaguing the content of malondialdehyde (MDA) and the activity of catalase (CAT) and peroxidase (POD) continuously. The results show that the infection of A. tenuissima. caused (MDA) content increased, catalase (CAT) and peroxidase (POD) activity was lower than that of the control. The different metabolic indexes of P. zhennan had different responses to pathogen infection.
Key words: Phoebe zhennan；Leaf blight；Alternaria tenuissima(Fr.)；Physiological effect
桢楠（楠木）是樟科(Lauraceae)楠属(Phoebe)的常绿大乔木[1]，可用于庭院、街道绿化，是我国著名的观赏树种之一[3]，桢楠的主要分布区位于亚热带的常绿阔叶林区，在我国主要分布于四川，重庆，云南，湖北的西部以及贵州的西北部等地[4][5]，多为野生和人工栽培[6]。楠木的适应力和生命力较强，有较好的抗病虫害能力，病害与虫害的发生相对于其他阔叶树种来说比较少[7]。关于桢楠病害没有相关研究，仅有桢楠的虫害与防治措施报道[8][9][10]，但近年来在成都温江绿道景区盆栽的桢楠上发现了疑似叶枯病症状，发病率较高，其病原尚未弄清。基于此，本研究采用组织分离法分离病原，结合形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析与致病性测定等方法鉴定桢楠叶枯病病原菌，并通过在健康植株上回接试验研究病原菌对桢楠生理生化方面的影响。
桢楠叶枯样本采自成都温江绿道景区盆栽种植的感病桢楠，桢楠平均株高1.2m左右。常规方法制作马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），采用组织分离法[11]纯化病原。选择发病症状典型的桢楠叶片，用自来水冲洗表面灰尘，自然晾干后用无菌滤纸吸干组织表面剩余水分。在超净工作台内，将桢楠叶片在70 %的酒精中浸泡30s左右，再在2%次氯酸钠消毒液中浸泡1-2 min，最后用无菌水连续冲洗3次，用无菌吸水纸蘸干叶片上多余水分，用无菌解剖刀沿着病健交界处切取小块组织数块，大小约5 mm × 5 mm，用灭菌的镊子挑取一小块病组织转入事先准备好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA培养皿内，每皿接种一小块，置于25 ℃恒温培养箱中培养，5 d后挑取不同形态菌落边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上反复培养，连续纯化3次，最后挑取菌落边缘菌丝斜面保存于4℃冰箱。
将分离纯化后的菌种移接于新制备的PDA培养基上，置于25℃的恒温培养箱中培养5d，观察并记录菌落的形态、颜色、生长情况。挑取菌落边缘菌丝制成切片，在电子显微镜下观察分生孢子形状、大小等的形态特征，参考真菌鉴定手册[12]作为病原菌鉴定的依据。
选取健康的桢楠叶片先用75%酒精表面消毒，无菌水擦洗2次，然后将纯化培养4-6天后的病原菌菌丝配置成悬浮液，接种时用灭菌的针刺叶片形成微伤口，接种病原菌悬浮液100μL于伤口处，以等量无菌水作为对照，每个处理6次重复，观察记录发病情况，对出现病状的叶片进行病原再分离，确认分离病原菌与接种病原菌是否一致。
将在PDA培养基上25 ℃恒温培养5 d后的菌落，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径5 mm的菌饼接种至150 mL装有灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)的锥形瓶中，置于25 ℃、140 r/min摇床震荡培养。5 d后用四层灭菌纱布过滤菌丝体，然后无菌水冲洗菌丝4次，置于50℃恒温鼓风箱内干燥1d。将收集到的烘干后的菌丝转移至消毒后的研钵内并倒入液氮，迅速研磨成粉末，最后置于-20℃冰箱中保存备用。DNA的具体提取步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Extraction Kit)，将最终提取出来的DNA置于-20℃的冰箱中保存。
将供试菌株的基因组DNA为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)真菌通用引物ITS4和ITS5进行扩增，序列如下：
ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'
扩增体系是总体积为25.0 μL，反应液为10 × Buffer 2.5 μL，DNA模板0.5 μL，引物ITS4和ITS5各1.0 μL，Taq酶12.5 μL，dd H2O 10.0 μL。PCR反应的程序：95℃预变性4 min；94℃变性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35个循环。最后72℃延伸10 min。
将纯化后的产物送至相关公司进行单向测序，根据测得的DNA片段序列，登陆NCBI进行比对，下载同源性较高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA5.0构建病原菌株的系统发育树。
选取长势相近的健康的盆栽桢楠6盆，用灭菌针刺伤其侧枝嫩叶形成微伤口，用无菌打孔器在培养5d的菌落边缘取直径5 mm的菌饼接于叶片伤口处，用纱布覆盖，每盆侧枝接种6个叶片，共接种3盆；对照组接种同直径的PDA培养基，每两天观察叶片变化。
1.3.2丙二醛(MDA)含量的测定
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化最重要的产物之一，在植物生理研究中MDA含量是一个非常重要的指标。通过对MDA含量的测定能了解膜脂过氧化的程度，也间接反映出细胞膜系统的受损程度。
称取感病的桢楠叶片1g，将叶片剪碎后放入研钵并加入2mL10%TCA和少量石英，砂研磨至匀浆后再加入8mLTCA进一步研磨。将上一步得到的匀浆在3000rmp离心10min，得到的上清液为样品提取液。
吸取离心的上清液2mL，对照为2mL蒸馏水，加入2mL0.6%TBA溶液，混匀后在沸水浴上反应15min，迅速放入冷水中冷却，再3000rmp离心10min。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。按公式算出MDA的浓度和样品中MDA的含量[13]：
C1=6.45(D532－D600)－0.56D450
MDA含量(μmol/g)=C1×提取液体积(mL)/植物组织鲜重(g)
式中：C1：MDA的浓度(μmol/L)；
D600、D532、D450分别代表600、532和450nm波长下的消光光度值。
酶液的提取：称取感病和健康的桢楠叶片1g，用自来水、70%酒精、2%次氯酸钠消毒液和无菌水将叶片表面处理干净后剪碎放入研钵，加入10mL20mmol/LKH2PO4研磨成匀浆，3000rmp离心15min，收集上层清液，低温保存。
反应混合液：吸取0.3mL愈创木酚加入pH6的100mmol/L磷酸缓冲溶液50mL于磁力搅拌器上加热，待愈创木酚溶解，溶液冷却后加入30%H2O220ul，混合均匀保存于冰箱。
取3mL反应混合液加入制备好的酶液0.1mL,对照组用等量100mmol/L磷酸缓冲溶液替代酶液，在470nm波长下测定吸光值的变化，每30s记录一次，连续测定3min，重复3次，以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位(μ)，按下列公式计算酶活力值[13] ：
酶活力(μ/min·mg)=(A2-A1)·D/0.01(t2-t1)W
式中：(t2-t1)为时间变化(min)；
(A2-A1)为(t2-t1)时间内吸光度的变化；
D为提取酶液总体积(5mL)/测定时取用酶液体积0.1mL；
W为样品鲜重(mg)。
酶液的提取：称取感病和健康的桢楠叶片各1g，用自来水、70%酒精、2%次氯酸钠消毒液和无菌水将叶片表面处理干净后剪碎放入研钵，加入10mL20mmol/LKH2PO4研磨成匀浆，3000rmp离心15min，收集上层清液，低温保存。
取3支10mL试管分别标记S1、S2、S3，分别加入酶液0.2mL、pH7.8的磷酸缓冲液1.5mL和无菌蒸馏水1.0mL。将S1号试管在沸水浴中煮1min以杀死酶，冷却至室温后再将3支试管25℃预热，逐一加入0.3mL0.1mol/L的H2O2。加完后迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每1min读数一次，共测3min，待3支试管测定完后，以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(U),按下列公式计算酶活性[13]：
过氧化氢酶活性(U/g·min)=ΔA240·D/0.1Wt
ΔA240=AS0-(AS1+AS2)/2
式中：AS0为沸水处理酶液管的吸光值；
AS1，AS2为样品管吸光值；
D为提取酶液总体积(5mL)/测定时取用酶液体积0.2mL
W为样品鲜重(mg)；
T为加入H2O2到最后一次读数时间(min)。
桢楠叶枯病主要危害桢楠老叶，4-5月份为病害高发期，病害从叶缘或叶尖发生，病斑呈不规则形，红褐色（图1），病健交界处明显，边缘呈深褐色，病斑由叶尖沿叶边缘或叶脉逐渐扩散到整个叶片，直至叶基部，严重时导致整个叶片扭曲、枯萎，少部分植株叶片大量脱落。在密集摆放的桢楠盆栽中，中部植株的发病程度明显高于外围植株。
病原菌接种于装有PDA培养基平板上，置于25℃，光暗交替的培养箱恒温培养箱中培养。观察和测量结果表明病原菌菌落平均生长速率为1.30cm/d，接种培养后第3天和第4天长势最快。培养一周后长势最好，菌落圆形或近圆形，直径约7.600cm，气生菌丝发达，多为灰白色绒毛状，质密、茂盛；整个菌落初期为白色，逐渐变为灰褐色，菌落边缘为白色，培养基背面颜色较深，呈深墨绿色或深灰黑色（图2），培养后期菌落会出现黑色轮纹。
图1 感病症状 图2 菌落正面图
Fig.1 Symptoms of disease Fig.2 The positive figure of colony
细极链格孢病原菌菌丝为透明状，分生孢子单生或者链生，呈长椭圆形（图3）、圆形，表面光滑，颜色为浅褐色，通常有2-6个横隔，2-3个纵膈膜，呈砖格状，顶端有短喙，大小为(20-44.5)μm×(7.5-13)μm；分生孢子链由7-11个分生孢子形成，少数分支，大多不分枝。根据上述孢子形态特征，将桢楠叶枯病病原菌初步鉴定为细极链格孢[Alternaria tenuissima(Fr.)]。
图3 分生孢子
Fig.3 The conidium
采用真菌通用引物ITS4和ITS5对桢楠叶枯病病原菌进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测，得到一条明亮清晰的片段。将收到的测序结果在NCBI中进行比对，选取NCBI中细极链格孢的rDNA-ITS序列，用软件MEGA5.0进行多重比对，采用NJ法构建系统发育树（图4）。结果表明该病原菌菌株的ITS序列与细极链格孢(Alternaria tenuissima)ITS序列同源性达到了100%，根据病原菌形态特征、rNDA-ITS序列同源性及系统发育树的分析结果，将导致桢楠叶枯病的病原菌鉴定为细极链格孢[Alternaria tenuissima(Fr.)]。
Alternaria tenuissima KF919124.1
Alternaria tenuissima KU508797.1
Alternaria peucedani NR 151840.1
Alternaria tenuissima MF574271.1
Alternaria tenuissima KR912298.1
Alternaria tenuissima JN986764.1
图4 基于ITS序列分析构建的叶枯病病原菌系统发育树
Fig.4 The phylogenetic tree of the pathogen causing leaf blight based on ITS sequence analysis
在健康的桢楠叶片上接种病菌后，通过每两天测定一次正常叶片与感病叶片MDA的含量发现，处理组的丙二醛(MDA)含量相对于对照组显著上升（图5）。测量第一天处理组MDA含量高于对照组2.27%，第三天高于对照组5.65%，第五天高于对照组11.6%，第七天高于对照组13.66%，第九天高于对照组15.15%，第十一天高于对照组17.39%，第十三天高于对照组17.24%。这一趋势说明叶片被菌感染后MDA含量显著上升，叶片内MDA大量堆积，可能原因是由于病菌的侵染引起脂质过氧化，结果导致细胞膜透性增大，膜结构受损。
图5 病菌对叶片MDA含量的影响
Fig.5 The effect of pathogen on MDA content of leaves
在健康的桢楠叶片上接种病原菌后，通过每两天测定一次正常叶片与感病叶片POD酶的含量。第一天POD酶活性与对照组相似，而从第三天开始，POD酶活性则呈一直下降的趋势（图6）。第三天POD酶活性下降约2.21%，第五天下降约4.02%，第七天下降约3.15%，第九天下降约6.25%，第十一天下降约8.97%，第十三天下降约8.97%。过氧化物酶(POD)是植物体内产生的一类氧化还原酶，能催化还原细胞内的过氧化物，从而起到保护细胞的作用，并且与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化都有密切关系。而接种菌之后，细胞的过氧化物酶活性降低，导致活性氧，如O2¯、H2O2等在植物细胞体内累积，使细胞功能受到损害，导致呼吸作用、光合作用等均受到不同程度的影响。
图6 病菌对叶片POD酶活性的影响
Fig.6 The effect of pathogen on POD activity of leaves
在健康的桢楠叶片上接种病菌后，通过每两天测定一次正常叶片与感病叶片CAT酶的含量（图7）。CAT酶活性的变化趋势与POD酶活性的变化趋势基本一致，第一天CAT酶活性处理组与对照组无明显差别，从第三天开始，CAT酶活性呈下降趋势，第三天CAT酶活性下降约5.19%，第五天下降约1.35%，第七天下降约4%，第九天下降约5.26%，第十一天下降约11.69%，第十三天下降约9.33%。
图7 病菌对叶片CAT酶活性的影响
Fig.7 The effect of pathogen on CAT activity of leaves
3 结论与讨论
本文通过组织分离法，从患有叶枯病的桢楠叶片上分离出可疑病原菌，通过在健康植株上回接病原菌完成柯赫氏验证、形态学观察结合分子生物学鉴定技术，确认致桢楠叶枯病的致病菌为细极链格孢[Alternaria tenuissima(Fr.)]，这与袁蒲英在桂花上发生的病原一致[ 14]。本文中桢楠的采样范围仅限于成都温江绿道景区，对病原菌的种群研究有一定的地域局限性，因此对于我国其他地区桢楠的发病情况和该病的致病菌株系有待进一步的研究。
植物在生物因素侵袭过程中，其生理代谢会发生紊乱[15－18]。环境胁迫诱发的活性氧自由基伤害生物膜过程中，最主要的膜脂过氧化产物是MDA，它的浓度表示膜脂过氧化强度和膜系统受伤害程度，可作为膜脂过氧化程度的一种指标[19]。MDA含量升高的幅度反映其寄主膜系统受到破坏的程度和膜脂过氧化水平的高低[20-21]。本试验中，感病桢楠叶片的丙二醛(MDA)含量显著升高，这一结果与张凯凯研究链格孢菌对菊花幼苗影响的结果一致[22]。
过氧化物酶(POD)是植物体内的一种氧化还原酶，具有消除过氧化物、胺类、苯类物质毒性的作用，从而对细胞产生保护作用。过氧化物酶中的标志酶就是过氧化氢酶(CAT),它在催化过氧化氢分解为氧和水的过程中十分重要。在本实验研究中，病原菌的侵染引起脂质过氧化作用，活性氧的浓度升高，在这种胁迫下，相关酶类POD、CAT酶的活性也相应发生变化。在感病初期，处理组POD酶活性高于对照组，是由于活性氧浓度的升高激活防御酶系统，细胞加速清除有毒害作用的活性氧，催化作用加强。由于活性氧在此期间大量积累，POD、CAT酶不能完全清除H2O2，活性氧的毒性作用又会影响酶的合成，进而酶活性降低，最终植株表现出感病性。随着细极链格孢的侵染，总体酶活性均呈下降趋势，表现低于对照组酶活性，处理组叶片感病部位已经出现病斑症状，表明细极链格孢菌的侵染己损坏桢楠叶片的部分细胞，严重影响了桢楠的观赏价值。这一结论与李荣金、万佐玺的研究结果一致[23，24]。本实验研究了细极链格孢对桢楠叶片生理生化影响的一部分研究，要做更深入、更全面的研究还需要从细极链格孢毒素的影响和侵染的亚显微结构等方面进行。
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