保健品中L-羟脯氨酸含量的液质联用测定

蔡伟江，陈晓霞，马召    

（汤臣倍健股份有限公司，广东  珠海  519040）

[摘要] 目的: 建立保健品中L-羟脯氨酸含量的测定方法。方法:采用高效液相色谱串联质谱法，色谱柱：安捷伦EC-C18,4.6mm×50mm, 2.7μm，流动相：水相（称取0.771g乙酸铵加水1.0L溶解，用乙酸调pH=3.5，过滤，即得。）和乙腈按一定的梯度进行洗脱，流速0.5ml/min。结果 L-羟脯氨酸的浓度与峰面积线性关系良好（R²=1.0000）,平均回收率为96.86%，RSD=1.7%（n=9）。结论 高效液相色谱串联质谱法可靠、灵敏、准确，可用于保健品中的L-羟脯氨酸的含量测定。 

关键词：L-羟脯氨酸；保健品；液质联用法；含量测定

Health care products in L-liquid ms determination of hydroxyproline content

   Cai Weijiang，Chen Xiaoxia，Ma Zhao

(By-Health Co.，Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)

[Abstract] Objective: To establish a method for determination of L-hydroxyproline content in health products.Methods: High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method. chromatographic column: Agilent EC-C18,4.6mm × 50mm, 2.7 μ m, mobile phase: phase (weigh 0.771g ammonium acetate with acetic acid to adjust the water solution of 1.0L, pH=3.5, filtering, namely.) and acetonitrile in certain gradient, the flow rate was 0.5ml/min.Results: The linear relationship between concentration and peak area was good (R²=1.0000), the average recovery was 96.86%, RSD=1.7% (n=9).Conclusion: High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method is reliable, sensitive and accurate, can be used for the determination of L-hydroxyproline content in health products.

Keywords: L-hydroxyproline; Health care products; Liquid mass coupon usage; Content determination

L-羟脯氨酸是一种亚氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上带有羟基(见图1)，但有时也在第3位上^[1]。为白色片状结晶性或结晶性粉末，呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料、清凉饮料等的风味的味质。有特殊风味，可作香原料。分子式：C₅H₉NO₃，分子量　131.13。熔点274℃。易溶于水，微溶于乙醇。L-羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，由测定的羟脯氨酸乘以一定的系数就可以得到胶原蛋白的含量，测定羟脯氨酸的方法有多种，包括分光光度法、氨基酸分析仪法、HPLC法和电泳法等,其中以分光光度法最为常见，如测定动物组织，猪肉^[2]、胶原海绵和鱼皮^[3]中羟脯氨酸的含量。为了准确地评价胶原蛋白的含量,本文探讨了高效液相色谱串联质谱法检测L-羟脯氨酸的含量。该方法更加简便，高效，准确。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

    L-羟脯氨酸标准品（来源：Sigma；批号：MKBH0984V，纯度：100%）；乙腈（色谱纯）；乙酸铵（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；蒸馏水。

超声波清洗器（EQ-500）；高效液相色谱仪（安捷伦1260）；色谱柱：安捷伦EC-C18,4.6mm×50mm, 2.7μm；质谱（API3200）美国AB公司，胶原蛋白口服液。

1.2 色谱条件

    流动相：水相（称取0.771g乙酸铵加水1.0L溶解，用乙酸调pH=3.5，过滤，即得。）

和乙腈，流速：0.4mL/min；柱温：40°C；时间：9 min ；进样量：5μL 。

1.3质谱条件

1.3.1以电喷雾离子源（ESI）阳离子模式，气帘气20psi，碰撞气6，喷雾电压5500V，离子源温度600°C，雾化气是50psi，辅助气是50psi,时间9 min。

1.3.2 L-羟脯氨酸质谱参数,见表1。

表1 L-羟脯氨酸的质谱MRM监测条件

132.07为母离子碎片，86.1为定量离子碎片，68.0为定性离子碎片。

1.4 标准品溶液的配制

    精确称取L-羟脯氨酸标准品5.74mg于100ml棕色容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，放在4℃的冰箱中储存备用。分别精密移取L-羟脯氨酸标准贮备液5.0ml、10.0ml、15.0ml、20.0ml、50.0ml于100ml棕色容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样量为5μl,以浓度C（mg/ml）为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,绘制标准工作曲线。

1.5 供试品溶液的制备^[4]

精密称取适量样品（约相当于羟脯氨酸2.76mg），置于25ml磨口的具塞比色管内，加6mol/L盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取1.0mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃～50℃减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%的甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，取滤液进样5μl。

1.6 线性实验

将标准品贮备液分别稀释成：0.00284mg/ml、0.00568mg/ml、0.00852mg/ml、0.01140mg/ml、0.02840mg/ml 5个浓度，经0.45μm的微孔滤膜过滤，每个浓度以5μL注入色谱系统。

1.7精密度实验

称取6份样品，按1.5试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD（%）。

1.8加标回收率实验

精密称取适量样品（约相当于羟脯氨酸2.76mg），共9份，置于25ml磨口的具塞比色管内，分成3组，每组3份，于每一组中分别加羟脯氨酸标准品2.18mg，3.22mg，3.76mg,加6mol/L盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取1.0mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于40℃～50℃减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%的甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即为供试品溶液，取滤液进样5μl。

1.9稳定性试验

取L-羟脯氨酸标准品液（浓度为0.00852mg/ml）分别在室温下放置0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后进样，进样量为5μl，计算其峰面积的相对标准偏差RSD（%），考察该方法的稳定性。

2  结果与讨论

2.1 色谱行为

采用液相质谱联用法能快速检测保健品中L-羟脯氨酸，不会因为其它因素而影响检测。采用流动相（甲醇：0.1%甲酸水 =55:45）时，9min就能把样品中L-羟脯氨酸流出。由于采用的是液质联用法，通过MRM模式进行母离子及相应的子离子进行检测，能达到准确的分离和定量。见图2和图3。

图2 L-羟脯氨酸标准品的质谱峰图

图3  样品的质谱峰图

2.2 线性实验结果，见表2。

表2  线性实验结果

线性评价：相关系数R²为1.0000,所以用该方法测定L-羟脯氨酸的含量，在浓度为0.00284mg/ml至0.0284mg/ml之间呈现良好的线性。

2.3 检出限和定量限试验：

分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比（S/N）计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析物浓度，QL定义为S/N=10时对应的分析物浓度。

2.3.1 检出限

 精密量取浓度为0.00284mg/ml的羟脯氨酸工作标准溶液1.0ml至100ml棕色瓶中,即得浓度为0.0284μg/ml的标准品溶液,再取该浓度的羟脯氨酸标准液3ml至25ml棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得浓度为：0.003408μg/ml，取信噪比为（3∶1）定方法的检出限浓度,DL＝0.003408μg /ml，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.00348μg/ml×500ml/1.2g =1.45μg/g。

2.3.2 定量限

 取信噪比为（10∶1）定方法的检测浓度为：QL＝0.00344μg/ml/3×10=0.01146μg/g，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：1.45μg/g×10/3=4.8μg/g。

2.4 精密度结果，见表3。

表3  精密度的实验结果

      从表3中可以看出，6个样的RSD为2.8%，具有良好的精密度。

2.5 稳定性试验的结果： L-羟脯氨酸标准溶液分别在室温下放置0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时，其峰面积的RSD（%）为：1.5%，表明L-羟脯氨酸标准溶液在室温下24小时内的稳定性较好。

2.6加标回收率实验，见表4。

表4  加标回收率实验结果

序号	样品称样量（g）	样品含量（mg/100ml）	测得对照品量(mg)	加标量(mg)	回收率（%）	平均回收率（%）	RSD（%）
1	1.9707	437.995	2.078020	2.18	95.322	96.86	1.7
2	2.0429	437.973	2.153731	2.18	98.795
3	2.0434	437.866	2.152178	2.18	98.723
4	2.0617	487.589	3.145329	3.22	97.681
5	2.0521	489.870	3.175151	3.22	98.607
6	2.0535	486.973	3.120802	3.22	96.919
7	1.9836	517.400	3.587947	3.76	95.424
8	1.9702	518.248	3.579574	3.76	95.201
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