干旱胁迫下转csp2基因和非转基因烟草抗旱生理比较

谢琳，代其林，周文波，马明莉，郭翠，王劲

1．西南科技大学极端环境生物资源利用实验室，绵阳，621000

2.中国农业科学院生物技术研究所，北京，100084

摘要：以转csp2基因和非转基因烟草为材料，用30%（W/V）PEG6000（聚乙二醇）进行干旱胁迫试验，比较研究了转csp2基因与非转基因烟草幼苗干旱胁迫处理的耐受性应答情况。研究结果表明：干旱胁迫下，转csp2基因烟草的叶片相对含水量、叶绿素含量以及抗氧化酶活性高于非转基因烟草，而丙二醛(MDA)含量低于非转基因烟草。结论：CSP2作为一种分子伴侣，广泛参与了烟草幼苗对干旱胁迫的耐受性应答过程，从而增强了植株的耐旱能力。

关键词：干旱胁迫；转csp2烟草；PEG6000

水分是植物生长不可或缺的要素之一，水分的缺失会对农业经济造成巨大的损失，在水资源不断匮乏的今天，培育耐旱性的植物品种显得尤为重要。随着分子生物学的发展，通过基因工程培育耐旱品种已成为一个主要研究方向^[1]。冷激蛋白（cold shock proteins Csps）作为细菌中RNA 的分子伴侣，含有原始型的冷休克结构域，具有与核酸结合功能，可以防止RNase 对mRNA 的降解，也能纠正mRNA 的折叠错误^[2]。近年来，冷激蛋白提高作物的胁迫抗性方面已经有研究成果。组成型表达大肠杆菌（E. coli）的CspA和来自嗜温菌（B. subtilis）的CspB提高拟南芥、水稻和玉米的非生物胁迫耐受性^[3]。Monsanto公司将B. subtilis 的cspB在玉米中表达，其干旱抗性显著提高，霉菌侵染明显降低，在水分胁迫的同等条件下，转基因玉米的产量相对提高^[4]。

本研究室从耐辐射异常球菌（Deinnoccus radiodurans DR1）中分离出由DR0907编码的蛋白Csp2为其特有蛋白，预测为该菌唯一的冷激蛋白，已有研究显示Csp2与细菌Csps同源物有高的序列相似性，并且含有典型的冷激结构域^[5]研究将DR0907基因转入甘蓝型烟草中，经过两代的筛选，得到T₂代种子作为实验材料。用30%的PEG6000模拟干旱条件，对转入Csp2的转基因和非转基因烟草进行抗旱生理比较。

目前，中国种植的烟草品种抗旱性较差，影响了烟草的大面积栽培和产量的提高。我们将csp2转入到烟草中，然后在浓度为30%的PEG6000胁迫下测定转基因和非转基因烟草的各项抗旱生理指标，初步探讨转入csp2能否提高烟草的抗旱能力，为开展耐旱研究提供新的思路和方法。

１材料和方法

1.1材料

选取转csp2烟草种子和非转基因烟草种子进行培育，获得T₂代转基因sp2烟草植株和非转基因烟草植株。

1.2 方法

1.2.1烟草无菌苗的获得 选取转基因烟草和非转基因烟草种子分别装入1.5ml离心管，用无菌水洗3次后，用75%的无水乙醇消毒2min，再用1%的次氯酸钠1ml消毒15min，最后用灭菌水冲洗3~4次，将转基因烟草种子转入含kan（50mg/L）的MS灭菌培养罐中进行抗性筛选培养，非转基因烟草种子转入不含kan的MS灭菌培养罐中，封口后置于光照时间为12h，温度为25℃的组培室中长至4片真叶。

1.2.2 萌发幼苗的移栽 将腐殖土和田园土按2:1的比例混匀放入花盆中，将转基因和非转基因烟草幼苗从MS培养基中移入花盆，用1/2Hoagland营养液培养，待幼苗生长4周时，提取转基因烟草的基因组进行PCR筛选，得到的第二代转基因烟草和非转基因烟草用Hoagland营养液培育至8片完全展开的真叶。

1.2.3 水分胁迫处理 用含30%PEG6000的Hoagland营养液模拟水分胁迫条件，进行干旱胁迫处理后，分别在0、1、2、3、7、14、21、28和35天（d），取同位叶片用于相关生理生化指标的测定，每个测定重复四次。

1.3相关生理生化指标的测定

1.3.1叶片含水量的测定 称取约 1.0g的烟草叶片于称量瓶中，在100～105℃烘干10min，80℃烘至恒重后称量，以（鲜重－干重)/鲜重来表示叶片的相对含水量^[6]。

1.3.2采用赵世杰等的硫代巴比妥酸（TBA）比色法，测定MDA含量^[7]。

1.3.3采用愈创木酚氧化法，测定过氧化物酶(POD)活性^[8]。 

1.3.4采用氮蓝四唑法，测定超氧化物歧化酶(SOD)活性^[8]。

1.3.5采用丙酮：酒精=2:1的混合液法，测定叶绿素含量^[9]。

1.4 数据分析 原始数据及图表均由Excel软件处理。

2.结果与分析

2.1 转基因烟草抗性植株的PCR鉴定

取用卡那霉素筛选出的烟草幼苗叶片和非转基因烟草幼苗叶片，用CTAB法提植物总DNA。以csp2 UP : 5’-ATGTGCCGAGTTTCGATTGT-3’和csp2 DOWN ：5’-TTACCAGCGGTCGTCGCGGC-3’为引物，烟草基因组DNA为模板，采用94℃预变性2min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，于72℃保温10min扩增。共检测经卡那霉素筛选出的烟草79株，鉴定出阳性的有56株。检验结果显示，转基因烟草叶片与阳性对照均扩增出422bp的预期条带，初步表明了csp2基因已导入到烟草中（图1）。

图1 转csp2烟草PCR检测

1:Maker；2:阴性对照(未转化苗)；3:阳性对照(质粒)；4～18:kan抗性植株

2.2 干旱胁迫对叶片含水量(RWC)的影响

干旱胁迫下，烟草叶片的含水量都逐渐下降，在0-14d期间，二者的含水量变化不大，在14d以后，其含水量减少较大，到35d时，非转基因烟草含水量已下降到60%，而转基因烟草的RWC平均值在76%（图2）。但与非转基因烟草相比，转基因烟草的含水量明显高于非转基因的含水量。

图2 PEG胁迫下叶片含水量的变化

2.3 干旱胁迫对丙二醛（MDA）的影响

经PEG6000胁迫后，转基因和非转基因的MDA含量都明显上升，但转基因烟草的MDA含量明显低于非转基因的MDA含量，到35d时，转基因烟草的MDA含量比转基因烟草低2/3，非转基因烟草的膜质在干旱胁迫下受损程度比转基因烟草的严重，表明csp2基因调节并增加了转基因烟草膜质的稳定性（图3）。

图3 非转基因烟草和转基因烟草在30%PEG6000胁迫下MDA的变化

2.4 干旱胁迫对氧化酶活性的影响

经30%PEG6000胁迫后，转基因烟草和非转基因烟草的抗氧化酶活性发生了明显的变化。在0-35d的胁迫时间内，二者的POD活性开始逐渐上升，7d后酶活性都达到最大值，分别为510.9和397.5 U.g^-1.min^-1，然后逐渐下降，但在整个胁迫时间内，转基因烟草的POD酶活性都高于非转基因烟草的酶活性。在这一过程中，转基因烟草和非转基因烟草的SOD活性也逐渐上升，在0－14d期间，二者的SOD酶活性差异不大。在14d后，非转基因烟草的SOD酶活性达到最大值，其后逐渐下降，而转入了csp2基因的烟草的SOD在14d后则持续上升，到35d时，转基因烟草的SOD活性比非转基因烟草高48%。说明csp2基因能够提高烟草的抗氧化酶的活性，具有较高的清除活性氧自由基的能力，从而降低了干旱对植株造成的损害。

图4非转基因烟草和转基因烟草在30%PEG6000胁迫下抗氧化酶活性的变化

2.5 干旱胁迫对叶绿素含量的影响

叶绿素含量的多少影响着植物对光能的吸收和转换效率。在30%PEG胁迫下，转基因和非转基因烟草叶片中的叶绿素含量开始逐渐上升，非转基因烟草叶绿素含量在胁迫后第3d达到最大值，转基因烟草在胁迫14d后达到最大值，然后二者均开始下降。但转基因烟草的叶绿素含量总体上都高于非转基因烟草的含量。

图5非转基因烟草和转基因烟草在30%PEG6000胁迫下叶绿素含量的变化

3 讨论

冷激蛋白主要作为RNA分子伴侣或转录增强子在细胞适应低温生存中发

挥着重要作用。并非所有的冷激蛋白都被冷激诱导，大量的研究表明很多冷激蛋白能被干旱胁迫或ABA诱导，表明大部分冷激蛋白在一般的细胞调控和代谢上发挥其他的作用。Lurie et al^[10-11]认为在不同胁迫蛋白之间必定存在某种功能上的重叠，一种胁迫的产生必定能增强其对其它胁迫忍受能力。根据目前CSPs研究进展，表明某些细菌CSPs能显著提高植物的抗旱等非生物胁迫耐受性和真菌侵染等生物抗性，并能有效提高作物产量。本研究将耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans R1)中分离出基因组DR0907编码的蛋白为该菌的唯一冷激蛋白。目前对该基因在植物中的抗旱性分析尚属首次。通过对转基因烟草进行30%PEG6000胁迫模拟干旱情况表明：在胁迫14d后，非转基因烟草叶片相对含水量，MDA含量持续升高，说明随着干旱程度的加重，非转基因烟草膜质过氧化程度变高，细胞水分流失严重，正常的生理代谢受到抑制。SOD和POD作为活性氧清除系统中重要的抗氧化酶，它们使活性氧的生产和清除维持在一个动态平衡状态^[12-13] 。当外界出现逆境胁迫时，会诱导植物产生氧化胁迫，进一步诱导SOD、POD活性的提高^[14-15],以有效地清除活性氧，避免或降低对细胞的伤害。在模拟干旱试验中，随着处理时间的延长，两种烟草叶片POD活性都呈先上升后下降的趋势。但是转基因烟草POD活性的增加明显高于非转基因。非转基因烟草的SOD活性在14d后开始下降，而转基因烟草的SOD活性持续增高。这样转基因烟草能更有效地清除活性氧、减少膜质过氧化。

叶绿素是植物叶片进行光合作用最重要的物质之一，其含量能直接反应植物光合作用能力^[16],30%PEG6000胁迫后叶绿素含量下降，影响捕获光能并转化成化学能的能力，使得光合速率明显下降。转基因烟草的叶绿素含量始终高于非转基因烟草，说明转基因烟草在干物质累积方面始终高于非转基因烟草。

综合试验结果分析表明，转csp2基因烟草各项生理指标均显著优于非转基因烟草，具有更强的耐干旱能力，且抗旱能力主要体现在胁迫后期。但是，csp2基因是如何对植物抗旱生理进行调控，是否还具有其它方面的作用，还有待于进一步的研究。

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