干旱胁迫对转csp2基因和非转基因烟草叶绿素荧光的影响

谢 琳，代其林，周文波，马明莉，郭 翠，王 劲

（1.西南科技大学极端环境生物资源利用实验室，绵阳，621000

2.中国农业科学院生物技术研究所，北京，100084）

摘要：以转csp2基因和非转基因烟草为材料，用30%（W/V）PEG6000（聚乙二醇）进行干旱胁迫试验，比较研究了转csp2基因与非转基因烟草幼苗在干旱胁迫条件下叶绿素荧光的变化情况。研究结果表明：干旱下，转csp2基因烟草的叶绿素荧光参数NPQ、ETR比非转基因烟草的低，而叶绿素荧光参数F₀、FV/FM、叶绿素含量均高于非转基因烟草。结论：Csp2作为一种分子伴侣，在逆境胁迫下能够提高植物光合作用，从而增强了植株的耐旱能力。

关键词：干旱胁迫；转csp2烟草；叶绿素荧光参数；PEG6000

冷激蛋白（Cold shock proteins，Csps）主要作为RNA分子伴侣或转录增强

子在细胞适应低温生存中发挥着重要作用。并非所有的冷激蛋白都被冷激诱导，大量的研究表明很多冷激蛋白能被干旱胁迫或ABA诱导，表明大部分冷激蛋白在一般的细胞调控和代谢上发挥其他的作用。Lurie et al^[1-2]认为在不同胁迫蛋白之间必定存在某种功能上的重叠，一种胁迫的产生必定能增强对其它胁迫忍受能力。根据目前CSPs研究进展，表明某些细菌CSPs能显著提高植物的抗旱等非生物胁迫耐受性和真菌侵染等生物抗性，并能有效提高作物产量。

本研究将耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans R1)中分离出基因组DR0907编码的蛋白Csp2为该菌的唯一冷激蛋白。目前对该基因在植物中的抗旱性分析尚属首次。试验通过测定叶片叶绿素荧光参数作为抗寒性鉴定的指标，目前叶绿素荧光参数作为农业领域的一项热门技术，已经广泛应用于农业生产和科研，尤其在鉴定评价作物的耐逆境能力如耐旱性、耐寒性、耐盐性等方面的应用越来越多^[3]。研究将csp2基因转入甘蓝型烟草中，经过两代的筛选，得到T₂代种子作为实验材料。用30%PEG6000模拟干旱条件，通过比对转基因烟草和非转基因烟草的叶绿素荧光参数，分析转入csp2基因的烟草是否能够提高植物在逆境胁迫下的光合作用，从而达到培育新型抗旱品种的目的。

１材料和方法

1.1材料

选取转csp2烟草种子和非转基因烟草种子进行培育，获得T₂代转基因烟草植株和非转基因烟草植株。

1.2 方法

1.2.1烟草无菌苗的获得   

选取转基因烟草和非转基因烟草种子分别装入1.5ml离心管，用无菌水洗3次后，用75%的无水乙醇消毒2min，再用1%的次氯酸钠1ml消毒15min，最后用灭菌水冲洗3~4次，将转基因烟草种子转入含kan（50mg/L）的MS灭菌培养罐中进行抗性筛选培养，非转基因烟草种子转入不含kan的MS灭菌培养罐中，封口后置于光照时间为12h，温度为25℃的组培室中长至4片真叶。

1.2.2 萌发幼苗的移栽

将腐殖土和田园土按2:1的比例混匀放入花盆中，将转基因和非转基因烟草幼苗从MS培养基中移入花盆，用1/2Hoagland营养液培养，待幼苗生长4周时，提取转基因烟草的基因组进行PCR筛选，得到的第二代转基因烟草和非转基因烟草用Hoagland营养液培育至8片完全展开的真叶。

1.2.3 水分胁迫处理 

用含30%PEG6000的Hoagland营养液模拟水分胁迫条件，进行干旱胁迫处理后，分别在0、1、2、3、7、14、21、28和35天（d），取同位叶片用于相关生理生化指标的测定，每个测定重复四次。

1.3相关生理生化指标的测定

1.3.1采用丙酮：酒精=2:1的混合液法，测定叶绿素含量^[4]。

1.3.2叶绿素荧光参数的测定

 叶片叶绿素荧光参数采用Dual PAM-100叶绿素荧光仪(德国Walz)进行测定。每次选取同一叶片的5个部位进行测定取平均值，测定时间为AM8:00~AM12:00。测定前叶片暗适应8h后，首先测定叶片的初始荧光F₀和Fv/Fm，再将烟草放置于正常光照条件下40min，测定电子传递速率（ETR）、非光化学猝灭（NPQ）。

1.4 数据分析

原始数据及图表均由Excel软件处理。

2.结果与分析

2.1 转基因烟草与非转基因烟草干旱期间形态变化

图1所示，干旱期间，转基因烟草与非转基因烟草在形态上的变化，从图上可以明显的观察到，胁迫前，转基因烟草和非转基因烟草在大小、生长势方面无明显变化，从胁迫7天（d）后，转基因烟草叶片只有叶片前缘有失水现象，而非转基因烟草的叶片已经全部萎焉失水，并且叶片开始出现枯萎，叶片部分发黄，胁迫35d时可以观察到，非转基因叶片已经发黄干枯，形成永久萎焉，而转入csp2基因的烟草植株虽然在胁迫后只是出现萎焉，叶片依然具有功能性。

图1非转基因和转csp2基因烟草在30%PEG6000模拟干旱胁迫试验中的形态变化

A~D是非转基因烟草的变化： A：胁迫前；B胁迫7d后；C胁迫14d后；D胁迫35d后；

E~F是转基因烟草的变化： E：胁迫前；F：胁迫7d后；G：胁迫14d后；H：胁迫35d后。

2.2 干旱胁迫对叶绿素含量的影响

叶绿素含量的多少影响着植物对光能的吸收和转换效率。在30%PEG6000胁迫下，转基因和非转基因烟草叶片中的叶绿素含量开始逐渐上升，非转基因烟草叶绿素含量在胁迫后第3d达到最大值，转基因烟草在胁迫14d后达到最大值，然后二者均开始下降。转基因烟草的叶绿素含量总体上都高于非转基因烟草的含量。

图2非转基因烟草和转基因烟草在30%PEG6000胁迫下叶绿素含量的变化

2.3干旱胁迫对叶绿素荧光特性的影响

初始荧光F₀是反映暗适应下PSⅡ反应中心开放时的荧光强度。F₀的增加可能是PSⅡ反应中心被破坏或内囊体膜受到损伤的表现且与叶绿素含量有关^[5-6]。随着胁迫时间的延长，转基因烟草和非转基因烟草叶片的F₀值在0~21d变化不大，在胁迫处理14d后，二者的F₀值都升高，但转基因烟草的F₀值高于非转基因的值，说明其PSⅡ的受损程度小于非转基因烟草受损程度，其光合速率受损比较轻微。

Fv/Fm是PSⅡ最大光化学量子产量，反映PSⅡ反应中心光能转换效率，是光抑制和胁迫程度的指标之一。经30%PEG6000胁迫后，转基因和非转基因烟草的Fv/Fm呈先上升后下降的趋势，但转基因烟草的Fv/Fm明显高于非转基因烟草。表明转基因烟草的PSⅡ活性中心受损伤程度比非转基因的小，非转基因烟草的光合作用的能力下降少，生长速度减缓或停止生长 ^[7-9]。

图3  PEG6000胁迫下烟草幼叶叶绿素荧光参数的变化

NPQ是衡量热耗散的重要指标，常用来评价植物耗散过多激发能的能力，一般认为，NPQ对植物光合机构具有一定的保护作用，是植物长期适应自然坏境形成的一种自我保护机制的反映。随着30%PEG胁迫时间的延长，二者的NPQ值呈下降趋势，但转基因烟草叶片的NPQ值明显高于非转基因烟草叶片的值。由此推测，转入了csp2基因烟草的PSⅡ具有更高的光化学效率，能够有效的释放过多的激发能^[10-11]。 

ETR是表观电子传递速率，主要体现PSⅡ反映中心电子传递情况。在本试验中，转基因和非转基因烟草的ETR均随着胁迫时间的增加而递减，但转基因的ETR值都高于非转基因烟草。表明30%PEG6000胁迫降低了PSⅡ的原初光能捕获能力，导致光合系统受损，转基因烟草的光合系统受损程度低于非转基因烟草^[12]。

3 讨论

叶绿素是植物叶片进行光合作用最重要的物质之一，其含量能直接反应植物光合作用能力，30%PEG6000胁迫后叶绿素含量下降，影响捕获光能并转化成化学能的能力，使得光合速率明显下降。叶绿素荧光参数F₀升高、Fv/Fm和ETR、NPQ下降，说明干旱胁迫影响了PSⅡ反应中心和电子传递速率以及热耗散能力。胁迫前期，转基因和非转基因烟草在各项指标中差别不大，到了胁迫后期（14d后），非转基因烟草与转基因烟草在各项指标间有显著性差异，F₀升高速率和Fv/Fm及 ETR、NPQ下降速率都高于转基因烟草。综合试验结果分析表明，转csp2基因烟草在叶绿素荧光参数上均显著优于非转基因油菜，尤其在干旱胁迫后期表现出转csp2基因烟草的抗旱能力。但是，转csp2基因是如何对植物抗旱生理进行调控，是否还具有其它方面的作用，还有待于进一步的研究。

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