影响非禽源外源病毒检验的主要因素

李淑芬，张秀华，和彦良，胡尚竞

（华威特江苏生物制药有限公司，泰州225300）

摘要：本文以《中华人民共和国兽药典》2015版三部非禽源外源病毒检验方法为依据，总结了检测过程中细胞状态、样品处理、接种与继代培养、荧光抗体检查等对外源病毒检验的影响，为企业提高外源病毒检验的准确度和检出率提供参考。

关键词：疫苗；外源病毒；细胞；样品处理；接种与继代培养。

Main Factors Affecting The Detection Of Non-avian Extraneous Agents Li shufen，Zhang xiuhua,He yanliang,Hu shangjing

(Sinovet (jiangsu) Biotechnology Co., Ltd.,taizhou 225300,china)

Abstract: Based on detection of extraneous agents in non-avian cells and the products propagated in these cells in Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Republic of China( 2015 Edition，Volume Ⅲ) ,the effects of cell state, sample preparation, Vaccination and subsequent culture, fluorescence antibody examination on the detection of extraneous agents were summarized  and provided reference to improve detection of extraneous agents in non-avian cells and the products．

Key words: vaccine; Extraneous Agents;cell; sample preparation; Vaccination and subsequent culture

高质量的疫苗是预防传染性疾病的重要手段之一。如果生物制品中存在外源病毒，有可能会引起使用对象动物产生疾病或干扰生物制品发挥作用，无法实现使用效果[1]。 同时，如果生产用细胞有外源病毒污染，更会导致连续生产的中断，对企业的经济效益带来不良影响。因此，外源病毒检验是生物制品安全、有效的重要保障。近年来，细胞培养法、动物实验法、血吸附检查病毒法作为传统的外源病毒检验方法已被广泛应用，成为筛查外源病毒的标准方法[2]。本文以《中华人民共和国兽药典》2015版三部非禽源外源病毒检验方法[3]即细胞培养法检测非禽源病毒类活疫苗展开讨论，为检验人员开展外源病毒检验提供借鉴，为企业提高外源病毒检出率提供参考。

1影响外源病毒检验的主要因素

1.1细胞

合格的细胞是生产和检验的基础，若细胞自身带有外源因子，作为生产用细胞其生产的产品不可避免会污染外源病毒，造成巨大的人力、财力损失；作为检验用细胞其检验结果毫无意义可言。因此，引入合格的细胞至关重要。根据孟淑芳[4]等对中国生产用细胞库的抽检，79株细胞中有5株存在外源病毒污染，这表明我国生产用细胞的纯净性面临重要挑战。在引入细胞时，应选择有资质机构，且细胞的纯净性有相关检验合格证明。其次，不同的细胞对病毒的敏感性是不一样的。如MDBK细胞对牛呼吸道合胞病毒BRSV不敏感，而Vero细胞对其较敏感；BVDV在Vero细胞上不复制，但在MDBK细胞上复制并可较敏感的检出[5]。这表明在样品检测过程中，除了按照药典要求选择细胞外，还应考虑样品的性质、可能污染的外源病毒种类来增加其他适宜的细胞来提高样品检出率。再次，细胞质量对外源病毒检验的结果判定非常重要。细胞质量的好坏影响CPE表现[6]，当细胞质量差时，细胞形态不规则，界线不清楚，无法准确判断CPE。因此，检验时应根据细胞的生长规律，优化细胞传代周期，传代比例、铺板密度、样品接种时细胞状态、培养时间等。通常情况下，在细胞传代时，应固定传代时间和细胞悬液密度，这样会使细胞形态规则齐整；传代扩瓶时，一般以细胞在24～48小时长成良好单层较适宜；铺板时一般以细胞在24小时长至70%左右为宜。细胞密度过低，在红细胞吸附检查时，洗涤过程中细胞易脱落，不利于观察；细胞密度过高，培养后细胞老化，实验结果会出现假阳性。

1.2 样品处理

        样品处理对检验结果的准确的重要因素之一。接种前应先对样品进行适当处理。按照兽药典规定取至少2瓶疫苗，按产品要求稀释至推荐头份，2000～3000g离心10分钟，取上清与56℃灭活30分钟的特异性抗血清振荡混合均匀， 37℃条件下中和1小时，期间摇振2至3次，作为待检样品。对于细胞继代产物，应在-70℃以下冻融3次，2000～3000g离心10分钟，取上清作为待检样品。在样品处理过程中有两点是检验结果准确的必要条件。一是抗血清的质量。与国外发达国家相比，我国的用于非禽源外源病毒检验的标准抗血清质量参差不齐，国家标准物质处提供的抗血清质量可靠，但是种类少，价格相对昂贵，在企业实际应用中限制较多。目前大多数企业均采用自行研制的抗血清进行外源病毒检验，这些抗血清的质量受限于公司检验水平，在质量上差异非常大。同时，由于国家强制免疫及养殖户疾病预防意识的提高，用来进行抗血清制备的阴性动物很难满足各种抗体均为阴性的要求，这就导致制备的抗血清大多为多克隆抗体，很少有单克隆抗体，在检验产品时由于存在其他抗体有可能会中和了一些病毒而使检验结果呈现假阴性。二是标准操作。样品处理过程中需要特别注意的是吸取上清步骤，应避免碰到管底及吸到细胞碎片。实验中发现当细胞碎片接种到细胞表面时，除了影响观察外，细胞的形态也会受到一定的影响，出现小颗粒状黑点、形态异常等，对于检查结果判断存在一定的误判风险。

1.3接种与继代培养

目前，经鉴定的病毒数量有2300种，而地球上的病毒种类可能超过150000种[7]。在检验过程中应根据病毒特性选择适宜的接种方式。常用的接种方式有同步接毒和细胞单层接毒两种方法。同步接毒，即将处理好的样品直接接种于细胞悬液，常用于PPV、MEV、BPV等细小病毒的接种[8]。细胞单层接毒，一般选择细胞长至75～90%融合，当细胞长至100%单层时，会对BVDV等病毒的繁殖有一定的影响，这个结果已经被魏至栋等人的实验所证实[4]。接毒后一般用无菌PBS或营养液轻轻洗涤1～2次，以减少血清毒性或补体作用，并排除未中和病毒。过程中，动作要轻柔，以免细胞脱落，影响后续观察。

根据2015版兽药典，接种量为2.0ml，至少含有1头份的疫苗。这一过程特异性抗血清的质量非常重要。合格的特异性抗血清首先应有足够高的中和能力，能够中和所对应的病毒。其次，毒性不应过大，不能影响细胞的正常生长和结果判定。再次，还应不含有中和病毒以外的其他病毒抗体，以免影响被检样品的检出率。在特殊情况下，特异性抗血清中和能力有限或存在中和不完全时，可在培养液中加适量的特异性抗血清。

继代培养次数，对于外源病毒检出率有很大的影响。秦焕美等人的实验表明每继代一次，对所含病毒可提高10倍检出几率[9]。因此，在检验过程中，如果出现不易判断情况，可考虑多继代一次，以便确保检验结果的准确。

1.4荧光抗体检查

荧光抗体检查法是通过荧光的方法用已知抗体检测样品中是否含有对应抗原的检测。敏感、特异的荧光抗体检测试剂盒是检验结果可靠的前提。2015版中国兽药典中猪用活疫苗、毒种和细胞需要进行BVDV、CSFV、PCV2荧光抗体检查；牛、马、绵羊和山羊用活疫苗、毒种和细胞需要进行BVDV荧光抗体检查；犬科、猫科或鼬科动物用活疫苗、毒种和细胞需要进行RV、CPV荧光抗体检查。目前我国可提供的荧光抗体检查试剂盒有BVDV、CSFV、PCV2，缺少RV和CPV。对于犬科、猫科或鼬科动物疫苗生产企业来讲，要进行RV和CPV检查，不得不从国外购买试剂盒，承受购买周期长、价格昂贵等不利因素，这在一定程度上限制了我国宠物疫苗的发展和壮大。另外，荧光抗体检查过程中，一抗、二抗的稀释度非常重要。抗体稀释倍数过高，荧光偏暗甚至无荧光；稀释倍数过低，荧光背景色较亮，影响观察，同时，会加大检验成本。因此，企业在进行检验时要根据病毒种类、抗体厂家等开展荧光抗体稀释倍数摸索。以下是2015版兽药典中要求进行荧光抗体检查的几种病毒的图片，为外源病毒检验人员提供一定参考。

图1 CSFV感染ST细胞                       图2 BVDV感染MDBK细胞

图3 PCV2感染PK-15细胞             图4 CPV感染CRFK细胞

根据中国兽医药品监察所历年抽查的不合格产品，因外源病毒不合格的产品占比非常大。以猪用病毒类制品为例，2008年～2018年共检出不合格产品99批次，其中外源病毒不合格34批次，是各类检验项目中问题最突出的，是产品质量的主要风险点。这充分表明了企业在外源病毒控制和检验水平上的不足，同时也反映了我国对外源病毒重视程度的逐步加深。细胞培养法检测外源病毒作为2015版中国兽药典指定方法，其灵敏度和病毒检测范围有着其他方法不可替代的优势，但受病毒敏感细胞株、标准抗血清、特异荧光抗体试剂盒等限制，同时检验周期长，人力、财力耗费大。随着新型检验技术的不断发展，透射电镜、酶联免疫法、血凝抑制试验、等方法都可用来进行外源病毒检验，特别是快速、灵敏、便宜的PCR技术正逐步得到认可和推广。目前BTV、ASFV、IBRV等PCR方法已被纳入国际贸易指定试验方法[10]，PRRSV、PCV、CSFV等PCR方法已被我国收入国家标准。但是PCR方法也具有显著的劣势，如必须知道是何种病毒才能进行，同时PCR方法全过程对环境要求严格，操作要求细致，否则假阳性概率偏高[11]。

鉴于每种检测方法都有一定的局限性，在生产中应结合预防措施来保证产品的安全。加强生产环节的控制，对人员操作进行严格要求和标准化规定，对环境进行有效消毒等。落实GMP 生产理念，安全、标准化生产。同时，常用的牛血清、胰酶可能有BVDV、弧长病毒等污染[12-13]，加强对动物源性辅料的检测和控制非常重要。通过这些综合措施，外源病毒的控制将会有很大的提高，产品的质量也将越来越好。

[1]Croghen D.L.Matehettt A.and Koski．T.A.1so-Latlon of  Porcine Parvovrus from Co mmercial Trypsin Applied Microbilogy，Sept,1973.431-433.

[2]Gregersen JP.Theory and Practice of Conventional Adventitious Virus Testing[J].PDA J Pharm Sc Technol，2011，65 ( 6 ) :634-644．

[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015年三部[S]．

[4] 孟淑芳，李修兰，冯建平，等．我国生物制品生产用细胞外源

因子污染情况检测[J]．中国生物制品学杂志，2006，19(6)：

627-632．

[5]魏至栋，鱼珂，刘艳等。牛肾细胞基质牛源病毒的控制和检测[J]。中国新药杂志，2012,21（10）:1170-1174.

[6]王树成，林建辉，刘宏等。用MDBK传代细胞繁殖BVDV毒株研究[J].中国动物检疫，1995,12（4）:6-8。

[7]Pastoret P P.Human and animal vaccine contaminations [J]. Biologicals,2010,38:332-334.

[8]Mengeling WL. Procine parvovirus Infection disease of swine (6^th ed),Iowe stale unversity press.s1986,411-424.

[9]吉林大学硕士学位论文，秦焕美，牛血清外源病毒检查方法比较和应用。

[10] 世界动物卫生组织． 陆生动物诊断试验和疫苗手册( 哺乳动

物、禽鸟与蜜蜂) 第五版[S].

[11]尚宏华，郭建平，谢秋梅.猪瘟活疫苗外源病毒BVDV细胞培养与PCR检测的比较[J].江西畜牧兽医杂志，2014,6:8-12.

[12] KHAN AS．Current testing methods and challenges for detection of

adventitious viruses[J]．PDA J Pharm Sci Technol，201 1，65

(6)：627-633．

[13] Kerr A，Nims R． Adventitious viruses detected in biopharmaceuti-cal bulk harvest samples over a 10 year period［J］. PDA J Pharm Sci Technol，2010，64( 5) : 481-485．