枸杞多糖通过TGFβ1/ Smad3 信号通路改善慢性心衰大鼠心肌纤维化

孟立立

沈阳陆军总院先心病科，辽宁 沈阳 110001

目的 探讨枸杞多糖对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响，初步探讨其作用机制。方法 通过腹主动脉缩窄法建立慢性心衰大鼠模型，建模成功后，随机分为模型组（CHF组）、枸杞多糖干预组（LBP组），另建立假手术组（sham组），LBP组给予枸杞多糖100mg/Kg灌胃，CHF组和LBP组给予等量生理盐水灌胃，8W后收集心脏结构参数，HE、Masson染色观察大鼠心肌组织病理变化，Western blot检测大鼠心肌组织中collagen I、collagenIII、TGF-β1、smad3、p-smad3的表达。结果 与Sham组相比，CHF组左心室舒张期末径（LVDD）、左心室收缩期末径(LVDS)、 右心室质量指数（LVESD）及左心室质量指数（LVMI）、TGF-β1、Smad3、p-smad3、collagen I和collagen III均明显升高(P＜0.05 vs sham），左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短分数（LVFS）明显降低(P＜0.05 vs sham），与CHF组相比，LBP组左心室舒张期末径（LVDD）、左心室舒张期末径（LVIDD)、左心室收缩期末径(LVDS)、右心室质量指数（LVESD）、TGF-β1、Smad3、p-smad3、collagen I和collagen III均明显降低(P＜0.05 vs CHF），左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短分数（LVFS）明显升高(P＜0.05 vs CHF）。结论 枸杞多糖可以抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化，其机制可能是通过下调TGFβ1/ Smad3 信号通路蛋白表达，减少心肌组织胶原纤维沉积实现的。

关键词：枸杞多糖；慢性心力衰竭；TGFβ1/ Smad3 信号通路；心肌纤维化

Lycium barbarum polysaccharide improves myocardial fibrosis in rats with chronic heart failure through TGF β1 / Smad3 signaling pathway

[Abstract] Objective to study the effect of lycium barbarum polysaccharide on myocardial fibrosis in rats with chronic heart failure. Methods by abdominal aorta constriction method to establish the rat model with chronic heart failure, after the success of the modeling, group (CHF) were randomly divided into model group, Chinese wolfberry polysaccharides intervention group (LBP), and control group (sham), LBP group was given LBP 100 mg/Kg lavage, CHF and LBP group gives the amount of saline lavage, 8 w after cardiac structural parameters collection, HE and Masson staining to observe rat myocardial tissue pathological changes, Western blot in the detection of myocardial tissue of rats collagen I, collagenIII, TGF - β 1, smad3, p - smad3 expression. Results compared with the Sham group, the CHF group final left ventricular diastolic diameter (LVDD), left ventricular systolic final diameter (an LVDS), right ventricular mass index (LVESD), left ventricular mass index (LVMI) and TGF - β 1, Smad3, p - Smad3, collagen I and III collagen were significantly increased (p < 0.05, vs Sham), left ventricular ejection fraction (LVEF), left ventricular short axis shortening fraction (LVFS) significantly decreased (p < 0.05, vs Sham), compared with CHF group, LBP group final left ventricular diastolic diameter (LVDD), left ventricular diastolic (LVIDD), left ventricular systolic final final diameter size (an LVDS), right ventricular mass index (LVESD), TGF - β 1, Smad3, p - Smad3, collagen I and III collagen were significantly lower (p < 0.05 vs CHF), left ventricular ejection fraction (LVEF), left ventricular short axis shortening fraction (LVFS) increased significantly (p < 0.05, vs CHF). Conclusion LBP can inhibit myocardial fibrosis in chronic heart failure rats and its mechanism may be through cut TGF β 1 / Smad3 signaling protein expression, reduce myocardial tissue collagen deposition.

[Key words] Lycium barbarum polysaccharide; Chronic heart failure; TGF purge 1/ Smad3 signaling pathway; Myocardial fibrosis

心力衰竭^[1]（heart failure HF）是高血压、冠心病、心律失常等心血管疾病的终末期阶段，临床主要表现为心室收缩功能和（或）舒张功能障碍，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群。流行病学调查表明^[2]，全球心衰患者约为2250万，我国心衰病变率约0.9~1.4%，患病人数达450万，虽然近年来各种药物治疗使心衰患者病死率呈下降趋势，但随着人口老龄化，人群心衰患病率显著增加。而心室重构^[3]（ventricular remodeling, VR）是慢性心力衰竭发生发展的主要原因，即心室肌的纤维化改变。枸杞多糖^[4]（lycium barbarum polysaccharide LBP）作为枸杞中的有效成分，具有抗氧化、抗衰老、缓解机体疲劳、调节血脂、调节血糖等多种生物活性。有研究发现，枸杞多糖对异丙肾上腺素导致的心力衰竭大鼠心肌具有保护作用，但其具体机制有待证实，TGFβ是调节细胞增殖、分化、凋亡的一种重要细胞因子，对细胞创伤和修复、免疫功能等具有重要作用，有研究发现^[5]，TGF-β1 信号通路是心梗后心肌修复及重构过程的主要调节因子，Smads蛋白是TGF-β1信号通路重要的下游调节因子，TGF-β1与其受体结合后磷酸化并激活Smads蛋白，可以发挥转录因子的功能，调节相关细胞因子的基因表达，最终导致纤维化。本研究通过观察枸杞多糖对慢性心肌衰竭大鼠心肌纤维化的影响，进一步探讨TGFβ1/ Smad3通路在其中的调控机制。

材料与方法

1.1实验动物及分组

SPF级SD大鼠40只，雄性，体重250~300g，由中国医科大学实验动物部提供（生产许可证号：SCXK(辽)-2013-0001，使用许可证号：SYXK(辽)-2013-0007），在无特定病原体实验动物设施中饲养，食水充足，自由取食。动物使用严格遵照中国医科大学管理委员会要求，在适应环境1W后，采用ACC的方式建立CHF模型，6W后通过心脏超声结合大鼠症状判断模型是否成功，采用随机数字表法将建模成功的大鼠随机分为模型组（CHF组）、枸杞多糖干预组（LBP组），另建立假手术组（sham组）。

1.2 慢性心力衰竭大鼠模型制备

参考文献^[6]采用ACC的方式建立CHF模型，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，剔除腹部部毛发，连接动物呼吸机、麻醉剂、监护仪，于左上腹纵行切开皮肤，逐层剥离肌层、胃肠脏器，暴露腹主动脉，在双肾动脉上方0.5cm处将27G针头与腹主动脉一同结扎后，抽出针头，造成腹主动脉管腔约50%~60%狭窄，闭合腹肌、皮肤。LBP组于建模成功后予100mg·Kg-1灌胃，CHF组及sham组予等量生理盐水灌胃，连续干预8W进行下一步实验。

1.3 心脏超声动态观察

干预结束后，在呼吸麻醉下观察，仰卧位固定，胸部剃毛，应用飞利浦公司CX-50超声心动仪，探头型号为S-12-4，频率4-12MHz。测定左心室舒张期末径（left ventricular internal dimension diastole  LVDD)、左心室收缩期末径(left ventricular internal dimension systole  LVDS)、左心室射血分数（Left ventricular ejection fraction  LVEF）、左心室短轴缩短分数（Left ventricular short axis shortening fraction LVFS）。连续取3个心动周期的平均值。

1.4样品采集与检测

干预结束后，大剂量水合氯醛处死后留取心脏，分析天平称取全心重量及左心室重量，计算右心室质量指数（left ventricular end-systolic diameter, LVESD）及左心室质量指数（left ventricular mass index, LVMI），取部分左心室心肌组织置于多聚甲醛中固定，部分置于液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存。

1.4.1 HE染色观察心肌组织病理学变化

取多聚甲醛中固定的心肌组织，流水冲洗1h，滤纸浸干，分别置于70%、80%、90%、100%酒精中，二甲苯中20min，浸蜡中3h，包埋机包埋，切片机切片，厚度在4~6μm之间，将切片放入37℃烤箱中过夜，再分别2次放入二甲苯中进行脱蜡处理，完成脱蜡的切片放入浓度递减的梯度酒精中脱水，之后进行苏木素染色5min，酸化水反兰，伊红染1min，分别浸80%、90%、95%、100%酒精1min，二甲苯5min，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.4.2 Masson染色观察心肌组织病理学变化

石蜡切片按常规方法脱蜡至水，经Regaud苏木素液染5min；95%乙醇洗2 次；在苦味酸乙醇液中分色，流水冲洗；再经丽春红酸性品红染色5min，用蒸馏水稍洗；经1%磷钼酸溶液处理5min，不经水洗，直接用醋酸苯胺蓝复染5min，再经1%冰醋酸处理1min，然后经95%乙醇、无水乙醇脱水多次，二甲苯透明，用中性树胶封片，于光镜下观察SAN形态结构。

1.4.3 Western blot检测CollagenI、CollagenIII、TGFβ1、Smad3的表达

将心肌组织置于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，于冰上对心肌组织进行匀浆，收集上清液后，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量后，对蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜后，加入TGF-β1(ab92486)，Smad3(ab40854)，p-Smad3(ab52903)，胶原蛋白I(ab34710)，胶原蛋白III(ab7778)抗体，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2小时后，使用ECL发光试剂盒和凝胶成像系统对蛋白进行显色，结果使用Quantity One进行吸光度分析。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 19.0软件进行分析处理。数据表示为均数±标准差(±s)，采用重复测量设计方差比较组内数据，采用单因素方差分析组间数据变异， P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物存活情况

   腹主动脉结扎术中及术后死亡7只，死亡原因考虑与术中感染和心力衰竭有关，实验期间模型组死亡1只，余组未见死亡。模型组大鼠于4W后开始出现精神萎靡、食欲不振、反应迟钝等症状，LBP组大鼠经干预后症状有所改善，sham组大鼠未出现上述症状。

2.2模型评价

   大鼠于AAC术后6W行心脏超声动态观察，结果如图1所示，与sham组大鼠相比，AAC大鼠LVDD、LVDS明显升高(P＜0.05 vs sham），LVEF、LVFS明显降低(P＜0.05 vs sham），均具有统计学意义，同时ACC大鼠出现呼吸困难、精神萎靡、食欲不振、反应迟钝等症状，基本符合实验动物心衰标准^[7]。

图1.各组大鼠血浆LVDD、LVDS、LVEF及LVES检测结果，*与sham相比（P＜0.05）

Figure 1. Test results of plasma LVDD, LVDS, LVEF and LVES in rats of each group, * compared with sham (P < 0.05)

2.3 心脏超声动态观察

   8W干预结束后行心脏超声动态观察，结果如图2所示，与Sham组相比，CHF组LVDD、LVDS明显升高(P＜0.05 vs sham），LVEF、LVFS明显降低(P＜0.05 vs sham），与CHF组相比，LBP组LVEF、LVFS明显降低(P＜0.05 vs CHF），LVDD、LVDS明显升高(P＜0.05 vs CHF）。差异均具有统计学意义，提示LBP可以改善CHF导致心室收缩功能和舒张功能障碍。

图2.各组大鼠血浆LVDD、LVDS、LVEF及LVES检测结果，*与sham组相比（P＜0.05），#与CHF组相比（P＜0.05）。

Figure 2. Plasma LVDD, LVDS, LVEF and LVES test results of rats in each group, * compared with sham group (P < 0.05), and # compared with CHF group (P < 0.05).

2.4 LVESD及LVMI情况

计算LVESD及LVMI情况，结果如图3所示，与sham组相比，CHF组LVESD、LVMI均明显升高(P＜0.05），提示CHF大鼠模型建立成功，与CHF组相比，LBP组LVESD、LVMI明显降低(P＜0.05），差异均具有统计学意义，提示LBP可以明显改善CHF导致的心室重构。

图3.各组大鼠LVESD及LVES结果，*与sham组相比（P＜0.05），#与CHF组相比（P＜0.05）。

Figure 3. Results of LVESD and LVES in rats of each group, * compared with sham group (P < 0.05), and # compared with CHF group (P < 0.05).

2.5 心肌组织病理学结果

HE染色示sham组大鼠心肌细胞形态正常，排列规则；CHF组大鼠心肌细胞出现明显肿胀，排列紊乱，大量炎性细胞浸润；与CHF组相比，LBP组大鼠心肌细胞肿胀明显改善，排列较规则，仅见少量炎性细胞浸润；提示LBP可以改善CHF导致的心肌细胞损伤。Masson染色示CHF组大鼠心肌组织见大量胶原纤维沉积，心肌纤维化程度较重；LBP组大鼠心肌组织中仅见少量胶原纤维沉积，纤维化程度较CHF组明显减轻，提示LBP可以抑制CHF导致的大鼠心肌组织纤维化

sham                 CHF                LBP

图4各组HE及Masson染色结果

Figure 4 HE and Masson staining results of each group

2.6 Western blot 检测CollagenI、CollagenIII、TGFβ1和Smad3蛋白

计算Western blot条带灰度值，结果如图5所示，与sham组相比，CHF组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、p-smad3、collagen I和collagen III表达明显升高（P＜0.05 vs sham）；与CHF组相比，LBP组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、p-smad3、collagen I和collagen III表达明显降低（P＜0.05 vs CHF），差异均具有统计学意义。

图5. Western blot检测各组大鼠心脏凋亡相关蛋白表达水平检测结果

Figure 5. Detection results of apoptosis-related protein expression levels by Western blot in each group

3 讨论

心力衰竭常发生于心血管疾病的终末期，可导致严重的循环功能障碍（circulatory dysfunction PICD），心室重构^[8]是慢性心衰发生发展的重要原因，心肌纤维化是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心脏重塑的主要表现，其主要病理变化包括细胞外基质过量沉积、纤维蛋白增生、各型胶原比例失调，引起心脏僵硬度增加，心脏舒张、收缩功能下降，胶原纤维^[9]是细胞外基质主要结构蛋白，心肌胶原纤维网主要由I型和III型胶原构成，其主要为心肌细胞提供支持框架，维持信使的几何形态，决定心室顺应性。在病理状态下^[10]，胶原合成和降解平衡失调，胶原逐渐累积，I型和III型胶原比例失调，引起室壁硬度增加，顺应性降低，心室收缩与舒张功能受损，最终导致心力衰竭。因此延缓或逆转心肌纤维化是防止心力衰竭的关键，本研究通过ACC增加大鼠心脏后负荷诱导的CHF大鼠模型为研究对象，结果发现，心衰发生8W后，超声可见大鼠LVDD、LVDS、LVESD、LVMI均明显升高，LVEF、LVFS明显降低，心肌细胞出现明显肿胀，排列紊乱，大量炎性细胞浸润，心肌组织中大量胶原纤维沉积，western blot检测心肌组织中Collagen I 和collagen III蛋白的表达明显增高。结果提示心衰发生后，发生了心脏胶原重构。

枸杞多糖作为枸杞子中的有效成分，近年来发现^[11]，LBP能够通过有效清除自由基、增强氧化酶的活性、减少氧化应激反应等途径提高机体的抗氧化能力，在细胞氧化损伤修复的过程中具有重要意义。本研究通过LBP对CHF大鼠进行干预，结果发现经LBP干预后，CHF大鼠LVDD、LVDS、LVESD、LVMI均明显降低，LVEF、LVFS明显升高，心肌纤维化减轻，心肌组织中Collagen I 和collagen III蛋白的表达明显降低，提示LBP可以减轻CHF导致的大鼠心肌纤维化，其作用机制可能与减少心肌组中的胶原纤维沉积有关。刘新岩等人用LBP干预异丙肾上腺素导致的CHF大鼠发现LBP可以抑制CHF大鼠心肌纤维化，这与本实验结果相符。

作为重要的促纤维化细胞因子^[12]，TGF-β1具有促纤维化、抗增生、抗炎症等作用。TGF-β1，参与调节成纤维细胞的增殖、转化、迁移、凋亡以及以胶原蛋白为主的细胞外基质的合成回，并同时诱导心肌成纤维细胞分化为有更强组织连接功能的肌成纤维细胞。Smads^[13]蛋白是TGF-β1下游的信号分子，是唯一可以和TGF-β1结合的底物，TGF-β1/Smads通路^[14]的激活在心肌纤维化过程中起重要作用。本研究发现CHF大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、p-smad3表达明显升高，经LBP治疗后大鼠心肌组中TGF-β1、Smad3、p-smad3表达明显降低，结果提示ACC导致的大鼠心力衰竭可能与TGF-β1/Smads通路激活促使心肌纤维化有关，而LBP能够抑制CHF大鼠心肌纤维化，其机制可能与调控TGF-β1/Smads通路有关。

综上所述，LBP能够从多方面抑制心力衰竭的发生发展，其具体机制可能与调控TGF-β1/Smads通路减少心肌组织胶原纤维沉积，抑制心肌纤维化有关，这一发现为心力衰竭的防治提供新思路。

参考文献

[1] Arnolda L F,Llewellyn-Smith I J,Minson J B. Animal models of heart failure.[J].  

Australian and New Zealand journal of medicine,2000,29(3).

[2] Gerber Yariv,Weston Susan A,Redfield Margaret M,Chamberlain Alanna  

M,Manemann Sheila M,Jiang Ruoxiang,Killian Jill M,Roger Véronique L. A contemporary appraisal of the heart failure epidemic in Olmsted County, Minnesota, 2000 to 2010.[J]. JAMA internal medicine,2015,175(6).

[3] Sorin Pop,Roxana Hodaş,Edvin Benedek,Diana Opincariu,Nora Rat,Laura  

Jani,Alexandra Stanescu,Monica Chitu,Imre Benedek,Theodora Benedek. Predictors of Left Ventricular Remodeling after Revascularized Acute Myocardial Infarction[J]. Journal of Interdisciplinary Medicine,2016,1(1).

[4] Yang Yu,Xiuquan Wu,Jingnan Pu,Peng Luo,Wenke Ma,Jiu Wang,Jialiang  

Wei,Yuanxin Wang,Zhou Fei. Lycium barbarum polysaccharide protects against oxygen glucose deprivation/reoxygenation-induced apoptosis and autophagic cell death via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in primary cultured hippocampal neurons[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2018,495(1).

[5]  Chen Keyan,Chen Wei,Liu Shi Li,Wu Tian Shi,Yu Kai Feng,Qi Jing,Wang  

Yijun,Yao Hui,Huang Xiao Yang,Han Ying,Hou Ping. Epigallocatechingallate attenuates myocardial injury in a mouse model of heart failure through TGFβ1/Smad3 signaling pathway.[J]. Molecular medicine reports,2018.

[6]  胡咏梅,李法琦,罗羽慧,余江恒.腹主动脉缩窄大鼠模型制作及临床意义[J].重

庆医科大学学报,2004(03):322-324.

[7]  Arnolda L F,Llewellyn-Smith I J,Minson J B. Animal models of heart failure.[J].  

Australian and New Zealand journal of medicine,2000,29(3).

[8]  Lottonen-Raikaslehto Line,Rissanen Riina,Gurzeler Erika,Merentie  

Mari,Huusko Jenni,Schneider Jurgen E,Liimatainen Timo,Ylä-Herttuala Seppo. Left ventricular remodeling leads to heart failure in mice with cardiac-specific overexpression of VEGF-B167: echocardiography and magnetic resonance imaging study.[J]. Physiological reports,2017,5(6).

[9]  Kevin Morine,Kyle Quinn,Lauren Baugh,Mark Aronovitz,Irene

Georgakoudi,Richard H Karas,Lauren Black,Navin Kapur. Abstract 19973: Decellularized Extracellular Matrix Exhibits Reduced Stiffness and Immature Collagen Deposition in a Mouse Model of Left Heart Failure[J]. Circulation,2015,132(Suppl_3 Su).

[10] Damatto R L,Martinez P F,Lima A R R,Cezar M D M,Campos D H S,Oliveira  

Junior S A,Guizoni D M,Bonomo C,Nakatani B T,Dal Pai Silva M,Carvalho R F,Okoshi K,Okoshi M P. Heart failure-induced skeletal myopathy in spontaneously hypertensive rats.[J]. International Journal of Cardiology,2012.

[11] 杨建军,胡淑婷,张焱,任彬彬,马金保.枸杞多糖对培养心肌细胞自由基损伤的

超微结构影响[J].中国中医基础医学杂志,2001(01):37-39.

[12] E. Long,R. Motwani,D. Reece,N. Pettit,J. Hepworth,P. Wong,P. Reynolds,R.

Seegmiller. The role of TGF-ß1 in osteoarthritis of the temporomandibular joint in two genetic mouse models[J]. Archives of Oral Biology,2016,67.

[13] Ramkumar Hariharan,M. Radhakrishna Pillai. Structure–function relationship

of inhibitory Smads: Structural flexibility contributes to functional divergence[J].  

Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics,2008,71(4).

[14] Yi-Lei Deng,Xian-Ze Xiong,Nan-Sheng Cheng. Organ fibrosis inhibited by    

blocking transforming growth factor-β signaling via peroxisome proliferator-activated receptor γ agonists[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International,2012,11(5).