摘要：目的 研究新生牛血清（newborn calf serum NBCS）γ－射线辐照后对BHK21细胞培养的影响。方法 用20kGy γ－射线辐照NBCS后培养BHK21细胞，通过连续传代培养和低密度生长曲线比较辐照前后的细胞生长效果。结果 NBCS辐照后连续传代培养10代，每代细胞生长良好，48h内形成致密单层，与辐照前没有明显区别。NBCS辐照前后低密度培养BHK21细胞第5代平均最大增殖密度为51.35×104/ml、51.20×104/ml（P＞0.05）、倍增时间21.89h、22.59h为（P＞0.05）；第10代为52.25×104/ml、52.73×104/ml（P＞0.05）和21.95h、21.62h（P＞0.05），生长曲线基本一致。结论 NBCS 20kGy γ－射线辐照后不影响BHK21细胞的培养效果。
关键词：新生牛血清；γ-射线；BHK21细胞
中图分类号：Q254       文献标识码：        文章编号：
Effect of 60Co Gamma Irradiated Newborn Calf Serum on BHK21 Cells Cellular Growth Performance 
DOU Xiaoxia1, MA Guilan2, WANG Jiamin1 LI Zhuo2and QIAO Zilin 1 
（1.Gansu Engineering Research Center for Animal Cell, Northwest University for Nationalities, Lanzhou, 730030, China; 2. Lanzhou Minhai Bio-engineering Co.,Ltd. Lanzhou, Gansu,730010, China）
Abstract: Objective To study the effect on BHK21 cells cellular growth performance of newborn calf serum（NBCS） treated with gamma irradiation. Methods NBCS was treated with gamma irradiation at a dose of 20kGy.BHK21cells Growth was determined by sequential subcultures and low cell density of irradiated NCBS compared to non-irradiated NCBS. Results There were no significantly difference from that of the gamma -irradiated NCBS and non-treated NBCS by 10 passages subculture of BHK21 cells, cell morphology in the gamma irradiated NCBS was consistent with that of the control cultures. the average maximum cell concentration and population doubling time（PDT）of the fifth and tenth sequential subcultures of NBCS before and after irradiation were 51.35×104/ml、51.20×104/ml（P＞0.05）21.89h、22.59h（P＞0.05）and 52.25×104/ml、52.73×104/ml（P＞0.05）and21.95h、21.62h（P＞0.05）,cells grew equally well in irradiated or control NBCS. Conclusion NBCS treated with a dose of 20kGy gamma irradiation, there were no effect on BHK21 cells growth haracteristics.
Key words：newborn calf serum;gamma irradiation;BHK21 cells
0 引言
新生牛血清（newborn calf serum NBCS）含有蛋白质、多肽、激素和生长因子等维持动物细胞贴附、增殖和生长所需的营养成分和生物因子，是动物细胞培养和生物制品生产的重要原辅材料[1]。批量生产的NBCS是上千头甚至几千头新生小牛采集分离的血清混合过滤制成一批次，小牛本身携带或在采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，直接使用存在生物安全分险。现阶段普遍采用的多级高效膜过滤系统能有效拦截NBCS中的细菌、真菌，甚至支原体等较大的微生物，但对病毒等更小的致病因子仍无法完全去除。为避免生物制品生产中使用NBCS带来的风险，研究能消除病原微生物又能最大限度地保留细胞培养所需的活性物质的处理方法，是NBCS大规模生产中重要课题，其中γ-射线处理是研究和应用最多的方法。目前国内已有的研究对NBCS辐照后培养CHO、Vero、CEF、Marc-145和ST细胞及其生产效果进行了报道，发现不同细胞对BNCS辐照剂量的耐用程度不同。BHK21细胞是口蹄疫疫苗唯一的生产细胞，而且口蹄疫疫苗在我国产量和产值均排第一的生物制品，为此进行了NBCS辐照后对BHK21细胞培养效果的研究，为培养该细胞所用的NBCS辐照提供依据。
1 材料与方法
1.1材料与设备
NBCS（兰州民海生物工程有限公司，批号：20100910、20110714、20110721和20110909，外包装箱为塑料泡面膜板箱外套瓦楞板纸箱，包装规格500ml×24瓶箱，内包装瓶为PET材质）。BHK21细胞（甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供），DMEM（Gibco，按说明书配制，0.22μm除菌过滤），消化液（Gibco， 0.25%胰蛋白酶+0.3‰EDTA-Na）。主要设备有CO2培养箱（美国ThermoFisher，3111，参数设置：37℃、5%CO2），相差倒置显微镜（日本Olympus，CKX41+DP73），细胞计数仪（美国 Roche Applied science, CASYTT）。
1.2方法
1.2.1NBCS的辐照处理
    从冷库取出包装好的整箱NBCS各一箱直接送兰州绿源辐照有限责任公司用20kGy剂量的60Coγ-射线同期辐照。辐照结束后检查解冻情况，每箱随机取3瓶在2-8℃自然解冻后混合进行试验，取1瓶同批次未辐照的NBCS做实验对照。
1.2.2 细胞培养效果测试
1.2.2.1连续传代培养
从液氮中取出冻存的BHK21细胞两支，在37℃水浴中快速复苏后用10%新生牛血清（批号：20100910）的培养液接种培养。细胞生长至单层后消化细胞，用DMEM培养基将两瓶细胞悬液混合平均分配到8个T25细胞培养瓶中，将所有辐照组和同批次未辐照的对照组共8个NBCS样品分别按8%浓度加到细胞悬液中混均后置培养箱培养。培养至48h时用相应NBCS按1∶4的分瓶比例传代培养，连续培养10代，在培养过程中观察细胞的生长情况，比较辐照组与对照组的培养效果。
1.2.2.2低密度生长曲线
    在NBCS培养细胞的第5代和第10代对数生长期末期，每组取一瓶细胞消化制成单细胞悬液，用含10%同组NBCS培养液调整细胞密度为2×104/ml，按每孔1ml接种24孔培养板，置37℃和5%CO2培养。每24h细胞消化3孔计算该时间点平均密度，计算第5和第10代所有样品辐照前后密度均数并绘制生长曲线，计算最大增殖密度和倍增时间[2]，用SPSS 21.0软件进行数据统计和方差分析法（AVOVA）进行差异显著性分析。
2结果
2.1样品处理后检查
NBCS辐照结束后带回实验室开箱检查，只有部分包装瓶上层NBCS有融化现象，大多数仍处于冰冻状态，排除在辐照过程中长时间放置于常温使血清解冻而影响细胞培养效果的可能，但辐照组透明性均有下降，解冻后瓶底白色沉淀物比对照组多。 
2.2 连续传代培养观察
辐照组和对照组NBCS连续培养BHK21细胞10代，所有细胞贴壁好，贴壁后大致成长梭形或不规则型，细胞核位于中央。细胞增殖较快，24h时70%以上生长面长满细胞，48h形成致密单层，呈放射状或漩涡状走势，培养液中悬浮的死细胞极少，组间没有明显差异，见图1。
图1.NBCS 60Coγ-射线辐照前后培养BHK21细胞状态图（第10代，20×）
Figure 1Effect of gamma-irradiation on BHK cell morphology (passage no 10 48h 20×)
2.3低密度生长曲线
NBCS辐照前后低密度培养BHK21细胞的第5代和第10代细胞生长曲线基本一致，细胞接种后潜伏期短，培养24h有明显增殖，48h-96h曲线很陡为指数生长期，96h-120h曲线变平缓为平台期，120h同期到达峰值，120h后曲线开始下降进入了衰退期，总体呈“S”型曲线，如图2所示。NBCS辐照前后低密度培养BHK21细胞第5代平均最大增殖密度为51.35×104/ml、51.20×104/ml，倍增时间为21.89h、22.59h；第10代为52.25×104/ml、52.73×104/ml和21.95h、21.62h。辐照前后同代次最大增殖密度和倍增时间组间差异均不显著（P＞0.05），且第5代和第10代最大增殖密度和倍增时间异均不显著（P＞0.05），统计结果见表1，说明NBCS辐照后不影响BHK21细胞的培养效果。
3讨论
NBCS因含有大量培养细胞所需的生物活性成份，在采集、加工、贮存和运输时尽量在低温状态下进行才能最大限度地保留其生物活性成份。60Coγ－射线辐照属冷处理，对冷冻状态存贮的NBCS不需要加温和加压过程，既达到了灭菌和破坏病原微生物的目的，又能最大限度地保留了血清中培养细胞所需的蛋白质、多肽、激素、生长因子和其它有益成份。


图2. NBCS 60Coγ-射线辐照前后培养细胞的生长曲线图
Fig.2 Effect of gamma-irradiation on BHK21 cells growth curve


    
表1  NBCS 60Coγ-射线辐照前后细胞最大增殖密度和倍增时间表
Table1 Effect of gamma-irradiation on maximum cell concentration and PDT of BHK2 cells
组  别 最大增殖密度（×104/ml） 倍增时间 （h）
平均值 P值 平均值 P值
辐照组第5代 51.20±2.63 0.95 22.59±0.77 0.19
对照组第5代 51.35±0.39 21.89±0.55
辐照组第10代 52.73±0.84 0.45 21.62±1.07
0.61


对照组第10代 52.25±0.86 21.95±0.60


而且60Coγ－射线的穿透力强，能够达到产品深处及大包装产品内部，对已包装密封的NBCS进行最后的处理工序可避免二次污染，方法快捷方便，也适合批量连续作业，是NBCS最
理想的处理方式。美国药典和欧洲法典要求对牛血清用25～40kGy剂量的γ－射线照射，而且认为这个剂量的γ－射线照射可消除外源性有害生物但不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响[3,4]。但是国内已有的报道证实[5-9]，NBCS辐照剂量10 kGy及以上时可杀灭细菌、霉菌、支原体、大肠杆菌噬菌体和牛病毒性腹泻病毒；18kGy时影响Vero细胞的生长；20kGy时对伪狂犬病毒繁殖和HbsAg分泌无影响，但对蓝耳病病毒繁殖有影响；25kGy以下时培养CEF、Marc-145和ST细胞生长状态良好，说明不同细胞对NBCS辐照的耐受程度不一致。造成NBCS γ－射线照射剂量不一对致的情况，可能是美国和欧洲大多都是原料血清在4.5L左右的装料桶包装，且4-6桶为一箱，为辐照后再过滤。而国内研究机构大多数都是500ml左右包装，用过滤分装的成品做研究，具体辐照的包装大小也没有明示。 
4结论
为确定特定包装的NBCS经γ－射线照射后对培养BHK21细胞的影响，将外包装箱为塑料泡面膜板箱外套瓦楞板纸箱，内包装瓶为PET材质，包装规格500ml×24瓶/箱的NBCS 经20 kG γ－射线照射后测试BHK21细胞的培养效果，结果表明连续培养10代时，每代细胞生长正常，在48h内均能形成致密单层，不同代次的低密度生长曲线、最大增殖密度和倍增时间与培养代次和未辐照的没有明显区别。
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