脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与HBV宫内感染的相关性

              任常军  徐瑞红 王萌萌 张明静 武利杰 郝玲

摘要：目的：了解新生儿脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与乙型肝炎病毒（HBV）宫内感染的关联性，为早期发现新生儿感染HBV提供帮助。方法：选择HBV感染的孕妇分娩的新生儿75例作为研究组，根据定性测得的乙肝两对半如乙肝表面抗原（HBSAg）、乙肝表面抗体（抗-HBS）、e抗原（HBeAg）、e抗体（抗-HBe）、核心抗体（抗-HBC）结果和定量测得的HBV-DNA值结果将研究组分为HBV宫内感染组17例，非宫内感染58例；并随机选择同一时间段内体检未发现异常的孕妇娩出的新生儿43例作为对照组，并使用不同的方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测IL-4水平、流式细胞术检测研究指标CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各数值水平。分析3组新生儿脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与HBV宫内感染的的相关性。结果：3组新生儿进行两两比较，宫内感染组脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与非宫内感染组相比，宫内感染组新生儿脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与对照组相比，差异分别具有统计学意义（P<0.05），而非宫内感染组新生儿脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与对照组没有统计学意义（P>0.05）。宫内感染组新生儿IL-4、CD8+明显高于非宫内感染组，CD4+、CD4+/CD8+明显低于非宫内感染组，差异分别具有统计学意义（P<0.05）。结论：HBV感染的孕妇分娩的新生儿脐静脉血IL-4水平升高，CD4+T细胞因子下降，CD8+T细胞因子升高，CD4+/CD8+比值下降，均有助于HBV宫内感染的早期发现和诊断。

关键词  新生儿；HBV宫内感染；白细胞介素-4；CD4+T ；CD8+T；CD4+/CD8+

Correlation between umbilical cord blood il-4, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+ and HBV intrauterine infection  REN Chang-jun, XU Rui-hong, WANG Meng-meng, ZHANG Ming- jing, WU Li-jie, HAO Ling．Department of Pediatric，The First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China

Corresponding author： HAO Ling  E-mail: 2475759137＠qq．com

【Abstract】Objective: to study the neonatal umbilical cord blood IL - 4, CD4 +, CD8 +, CD4 + / CD8 + and the relevance of hepatitis b virus (HBV) intrauterine infection and provide help for the early diagnosis of neonatal HBV infection. Methods: choose 75 cases with neonatal HBV infected pregnant childbirth as a team, according to the qualitative determination of second liver two half-and-half, such as hepatitis b surface antigen (HBSAg), hepatitis b surface antibody (anti - HBS), e antigen (HBeAg), e antibody (anti - HBe), core antibody (anti - HBC) and quantitative determination of HBV - DNA values will be the team divided into HBV intrauterine infection group of 17 cases, 58 cases of intrauterine infection; not occurring And to choose a sample of a healthy pregnant woman in the same time period 43 of the newborns in the control group, and to use a different method like the enzyme link immunosorption (ELISA) method to determine the rate of the il-4, the flow cytometry of the CD4 +, CD8 +, CD4 + / CD8 +, the Numbers of the index. The correlation between il-4, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+ and HBV intrauterine infection was analyzed. Results: Three groups of newborns are compared, and two intrauterine infection group of umbilical cord blood IL - 4, CD4 +, CD8 +, CD4 + / CD8 + compared with the intrauterine infection group, intrauterine infection group of neonatal umbilical cord blood IL - 4, CD4 +, CD8 +, CD4 + / CD8 + compared with control group, the differences were statistically significant (P < 0.05), rather than the intrauterine infection group of neonatal umbilical cord blood IL - 4, CD4 +, CD8 +, CD4 + / CD8 + and the control group there is no statistical significance (P > 0.05).The neonatal il-4, the CD8 + is significantly higher than the absence of an intrauterine infection, CD4 +, CD4 + / CD8 +, which is significantly lower than the absence of an intrauterine infection, and the difference is statistically significant. Conclusion: neonatal umbilical cord blood immune factor IL - 4 levels, and CD4 + T cell factor, CD8 + T cells factor increases, CD4 + / CD8 + ratio decreased, due to all help in the early detection and diagnosis of HBV intrauterine infection.

【Key words】  Newborn；HBV intrauterine infection；Interleukin-4；CD4+T；CD8+T；CD4+/CD8+

慢性乙型肝炎病毒感染是一个全球关注的严重影响健康问题，围产期母婴垂直传播(MTIT)是发生宫内感染的主要方式之一。宫内感染是指新生儿通过接触母亲含有病毒的血液或体液成分而传播，是HBV传播的主要途径[1]，是形成慢性乙肝的重要原因。通过有效的方式，尽可能避免母婴垂直传播是防治HBV宫内感染的主要方法。现阶段对HBV宫内感染的研究，越来越关注于对新生儿脐血的研究。本研究探讨发生HBV宫内感染组与新生儿脐血IL-4、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+的相关性，为我们早期发现和诊断HBV宫内感染提供线索。

1. 对象与方法

1.1研究对象  选择我院和石家庄市五院2016年5月至2017年12月住院的均为汉族孕妇娩出的新生儿共118例，包括HBV感染的孕妇分娩新生儿75例为研究组，研究组又分为发生宫内感染组17例，非宫内感染组58例；未感染乙肝肝炎病毒的健康孕妇43例为对照组。HBV感染的产妇均符合慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准，未感染其他病毒，同时满足以下条件：孕期无其他系统疾病且胎儿无畸形、丈夫健康。118例孕妇的年龄、怀孕周数、胎次、产次、何种分娩方式与新生儿的体重、性别方面进行比较均没有统计学意义（P>0.05）见表1。

表1   各组新生儿一般临床资料进行统计学比较［+s，M(Q25,Q75)］

1.2检测方法：孕妇娩出胎儿并进行脐带结扎后，选择脐静脉，采集脐血6ml，分装于2支管，每支均为3ml。一支管采用酶链免疫吸附测定（ELISA）法测得的乙肝两对半如乙肝表面抗原（HBSAg）、乙肝表面抗体（抗-HBS）、e抗原（HBeAg）、e抗体（抗-HBe）、核心抗体（抗-HBC）各指标的阴阳性，采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法定量测定HBV-DNA数值水平；使用ELISA法和流式细胞学术检测脐静脉血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+研究指标数值。

1.3宫内感染诊断标准

胎儿娩出后，收集新生儿的脐带血行乙肝两对半和HBV-DNA定量检测，如HBV-DNA（＞1.00×10³copies/mL）或（和）HBsAg呈阳性，诊断为HBV宫内感染，脐血HBV-DNA（<1.00×10³copies/mL）和HBsAg阴性则诊断非HBV宫内感染。

1.4统计学分析

通过应用SPSS 21.0软件对收集的资料进行整理并进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料使用均数和标准差（ x ± s）进行统计分析,两两比较应用LSD-t法，单因素方差法对三组间比较进行统计分析。关于非正态分布的计量资料使用M(Q_L,Q_U)描述，不符合方差齐条件的使用Kruskal-Wallis H 进行检验。用百分数（%）描述计数资料，三组间的比较采用R*C表的c²检验。P＜0.05认为差异存在统计学意义。

2.结果

3组研究对象分别进行脐带血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较

三组间两两进行比较，宫内感染组与非宫内感染组进行相比，宫内感染组IL-4、CD8+水平明显高于非宫内感染组，CD4+、CD4+/CD8+水平均低于非宫内感染组，差异分别具有统计学意义（P<0.05）；宫内感染组与对照组对纳入各研究指标进行比较，差异分别具有统计学意义（P<0.05），非宫内感染组与对照组对各研究指标IL-4、CD4+、CD8+水平与CD4+/CD8+比值进行相比，差异分别没有统计学意义（P>0.05）。见表2

表2   IL-4、CD4 +、CD8+、CD4+/CD8+比值各指标进行比较［+s，M(Q25,Q75)］

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与感染组比较，P＜0.01；3）^△：F值 ,#: c²  

讨论：

HBV感染者越来越多，受到人们高度关注。母婴垂直传播是HBV感染的主要传播途径，及时发现并给予相应处理，是有效控制HBV感染的主要措施。母体e抗原阳性和HBV-DNA高载量对宫内HBV感染的诊断具有重要的意义[2]，HBV宫内感染的发生与一些免疫细胞因子失衡具有密切的关联。由于细胞因子在个体的免疫、抗病毒的能力与病毒的清除等方面具有至关重要的作用，如IL-4、CD4+T细胞在机体清除病毒方面发挥重大作用。CD4+T（ThO）细胞分别在IL-2和IL-4因子的作用下分化为两个亚群TH1和TH2[3]。TH2细胞分泌IL-4水平升高，从而其介导的体液免疫反应增强，另一方面IL-4介导的体液免疫反应增强可抑制IL-2介导的细胞免疫反应，使细胞免疫反应减弱，使HBV不能被有效清除，处于持续感染状态[4][5]。

HBV感染时机体树突状细胞可刺激T淋巴细胞活化和增值，HBV感染树突状细胞受损引起免疫紊乱，是肝脏慢性炎性损伤的关键因素[6]。PobleteA[7]等报道感染HBV的孕妇可引                      起体内白细胞计数、T淋巴细胞亚群发生变化，使发生宫内感染的新生儿细胞数目发生相应  的改变。CD4+不仅代表辅助性T细胞（Th），主要调节体液免疫反应，还代表诱导性T细胞（Ti）,促使B淋巴细胞的活化和增值，有助于细胞毒性T细胞和巨噬细胞介导免疫反应造成肝脏炎性损伤[8]。慢性HBV感染时，CD4+T细胞在质和量上均发生改变，导致病毒不能被有效的清除。CD8+不仅代表杀伤性T细胞（CTL）介导T细胞免疫应答，能够杀灭特指抗原的靶细胞，具有抑制性T细胞（Ts）的作用，抑制机体CD4+T细胞的分泌，导致细胞免疫反应减弱使病毒感染。有研究[9]发现辅助性T淋巴细胞能力低下也是宫腔内感染HBV后免疫失败引起持续感染的重要原因。感染急性乙型肝炎病毒的过程中，CD8+细胞介导的毒性T细胞和CD4+T细胞介导的辅助性T细胞介导的免疫应答被激活，参与肝细胞清除乙型肝炎病毒[10]。慢性HBV感染最终引CTL的特异性免疫数目减少，非特异性免疫细胞数目增多，进一步削弱机体的免疫力，从而使感染加重[11]。Ts细胞在一定程度上对其他免疫细胞起抑制作用，对其自身细胞可通过负反馈调节起作用[12]。在机体感染HBV时，Ts细胞抑制机体CD4+T淋巴细胞的免疫应答，CD4+T细胞免疫应答减弱并使Ti细胞数量减少，抑制性T细胞数目的增多，杀伤性T细胞数目的减少，从而使CD8+T（Ts/CTL）细胞数增多，以致CD4+/CD8+比值相对降低，造成乙型肝炎病毒难以被清除[13]。CD4+T和CD8+T细胞数目的改变与HBV病毒特异性免疫应答和病毒清除方面密切相关。CD4+/CD8+的比值在某种程度上反应机体的免疫调节能力。正常人体T细胞亚群中CD4+T细胞和CD8+T细胞处于相对稳定状态。HBV感染存在时，机体CD4+T细胞数目减少和CD8+T细胞数目进一步增多，CD4+T细胞和CD8+T细胞之间的平衡失去调节，CD4+/CD8+比值下降，进一步抑制机体的免疫反应，导致HBV处于持续感染状态。

HBV感染是机体与病毒之间相互作用的过程[14]。相关研究发现[15]HBV感染孕妇后体内IL-12分泌水平低下，TH1细胞功能减弱，分泌INF-γ水平降低，TH2细胞分泌IL-4水平增高，使TH1/TH2细胞失衡，发生免疫紊乱，使机体抗病毒能力减弱，从而导致机体处于HBV持续感染状态，易发生HBV宫内感染，与AkpolatN,[16]等研究结果相同。李艳[17]等研究说明孕妇感染HBV后细胞免疫功能失衡，致使IFN-γ抗病毒功能低下，IL-4水平相对升高，易发生胎儿宫内感染，而新生儿脐血中INF-γ、IL-4水平明显偏低，Th1/Th2型免疫平衡在HBV宫内感染的发病机制中起到关键作用。这一结果与栗军香等[18]的研究相一致。本研究发现HBV宫内感染组脐血IL-4水平明显高于非宫内感染组。感染HBV后机体特异性T淋巴细胞发挥免疫作用，对有效的清除病毒感染具有重要意义，T细胞免疫反应的能力决定了机体免疫调节功能，对机体是否发病、病情的轻重及预后起到决定性作用[19-20]。余敏敏等研究[21]，孕妇HBV病毒感染新生儿后机体免疫调节功能低下，考虑与HBV感染机体后特异性刺激机体使之发生免疫紊乱，T淋巴细胞总数相对无明显变化，而CD4+T淋巴细胞数目下降，CD8+T淋巴细胞数目相对升高，引起CD4+/CD8+比值相对下降。有一些研究结果显示，宫内感染HBV时机体发生免疫失败，免疫耐受是其发生的主要机制[22]。感染HBV的新生儿脐血T细胞亚群中各细胞数目发生变化，T淋巴细胞发挥调节特异性免疫作用减弱，考虑与机体发生免疫耐受有密切相关。有关研究[21][23]发现：与非宫内感染组相比，HBV宫内感染组新生儿外周血CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值均降低；宫内感染组外周血CD8+细胞升高。杜二球等研究发现：发生宫内感染组新生儿脐血CD4+T淋巴细胞百分数相对下降，CD8+T淋巴细胞百分数相对升高，从而导致CD4+/CD8+比值降低[24]。以上两组研究表明：发生HBV宫内感染时新生儿不仅外周血而且脐血CD4+T细胞水平、CD8+T细胞水平与CD4+/CD8+比值均发生相应变化，这种变化具有一定的关联性。本课题研究发现HBV宫内感染组的新生儿脐血CD4+T细胞百分数低于非宫内感染组，CD8+T细胞百分数高于非宫内感染组，发生宫内感染组CD4+/CD8+比值下降，本研究发现发生脐血IL-4、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值的变化对HBV宫内感染的早期发现及临床诊断具有重要作用。

新生儿的细胞免疫功能未发育成熟，一些免疫细胞因子数目少且发挥免疫能力弱，易发生免疫抑制或免疫耐受，使新生儿不能有效的清除机体内的病毒而使感染持续存在，从而发生HBV宫内感染。检测新生儿脐血IL-4水平可大致了解TH1/TH2细胞的免疫反应水平，对新生儿宫内感染的发生做出预测。检测新生儿脐血CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+有助于了解机体的免疫功能状态。陈旭芳[25]报道新生儿T淋巴细胞的免疫功能不完善，并且非特异性免疫功能低下，容易发生HBV宫内感染。检测新生儿脐血IL-4、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+比值的变化，有助于HBV宫内感染的诊断并及时给予干预治疗。本实验数研究新生儿脐血数据尚少且未涉及发生HBV感染时孕妇血清学改变，本课题需进一步研究HBV感染的孕妇血清学改变及新生儿脐血相关的数据为新生儿发生HBV的感染的早期诊断及干预治疗提供帮助。

参考文献：

[1]Hung HF ,Chen HH,et al, Cost-effectiveness analysis of prophylactic lamivudine use in preventing vertical transmission of hepatitis b virus infection[J]，Pharmacoeconomics. 2011,29：1063-1073.

[2]LIN J, LIAO S, HANLJ et al. Correlation neonatal hepatitis B and matemal serum       hepatitis B virus DNA copies[J].Pediatr Res,2000,47:342.

[3]Chace JH, Hooker NA, Mildenstein KL, Krieg AM, Cowdery JS. Bacterial DNA-induced NK cell IFN-gamma production is dependent on macrophage secretion of IL-12[J]. Clinical immunology and immunopathology 1997; 84(2): 185-93.

[4]Klein W, Tromm A, Griga T, et al. Interleukin-4 and interleukin-4 receptor gene polymorphisms in inflammatory bowel diseases[J]. Genes and immunity 2001; 2(5): 287-9.[4] Klein W, Tromm A, Griga T, et al. Interleukin-4 and interleukin-4 receptor gene polymorphisms in inflammatory bowel diseases[J]. Genes and immunity 2001; 2(5): 287-9.

[5]韩亚萍，李 军，蒋龙凤，等.HBeAg导致慢性乙型肝炎患者血Th1/Th2型细胞因子失衡[J].中华肝脏病杂志，2013,21（8）：20.

[6]Bertoletti A, Gehring AJ. The immune response during hepatitis B virus infection[J]. The Journal of general virology 2006; 87(Pt 6): 1439-49.

[7]Poblete, A, Roberts, A. Trespidi, L.Fetal and maternal white cells and B-and T-lymphocyte subpopulations in pregnant women with recent infection[J].Fetal Diagn Ther,2001,16（6）:378-83

[8]Roit L,Bmstoff J,Male D.免疫学[M].6版，周光炎，译，北京：人民卫生出版社，2002:53-56.

[9]王建设, 朱启镕. 宫内感染乙型肝炎病毒免疫失败儿童1型和2型细胞因子研究[J]. 中华儿科杂志 2002; (08): 36-9.

[10]Thimme R, Wieland S, Steiger C, et al. CD8(+) T cells mediate viral clearance

and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection[J]. Journal of virology 2003; 77(1): 68-76.

[11]Manini MK,Boni C, Lee CK,et al.The role of virue -specific CD8+ cells in livelr damage and viral control during persisent hepatitis B virus infection [J].Exp Med,2000,191(8):1269-80.

[12]王敏, 王福生, 刘敬超. 慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群与病程相关性的研究[J]. 肝脏 2003; (02): 18-20.

[13]Choong ML, Ton SH, Cheong SK. The cellular immune status of HBsAg-positive carriers in Malaysia[J]. Asian Pacific journal of allergy and immunology 1996; 14(1): 19-24.

[14]Guidotti LG, Isogawa M, Chisari FV. Host-virus interactions in hepatitis B virus infection[J].Curr Opin Immunol,2015,36:61-6.

[15]罗琼, 李景平. IL-12的表达与细胞因子IFN-γ、IL-4在HBV宫内感染的相关性[J]. 山西医科大学学报 2013; (08): 645-8.

[16]Akpolat N, Yahsi S, et al. Relationship between serum cytokine levels and bistopathological changes of liver in patients with hepatitis B [J].World J Gastroenterol,2005,11(21):3260-3. 

[17]李艳, 张红梅, 沈佳芳. 乙型肝炎病毒感染孕妇IL-2、IFN-γ和IL-4、IL-6与宫内感染的相关性研究[J]. 亚太传统医药 2012; (10): 84-5.

[18]栗军香, 沈香荣, 郑丽娟, et al. 乙型肝炎病毒母婴垂直传播与Th1/Th2型细胞因子相关性研究[J]. 现代中西医结合杂志 2016; (29): 3269-71..

[19]殷缨, 张盈华, 张利朝. 乙肝病程发展中CD4/CD8、TNF-α及sIL-2R水平变化及意义[J]. 免疫学杂志 2002; (01): 74.

[20]李俊卿, 周俊英. 免疫细胞在慢性乙型肝炎免疫耐受机制中的作用[J]. 临床肝胆病杂志 2011; (04): 437-40.

[21]余敏敏, 韩国荣, 王建芳. 新生儿宫内感染乙型肝炎病毒后T淋巴细胞亚群的变化[J]. 中国实用妇科与产科杂志 2006; (05): 364-6.

[22]鞠丽丽, 余敏敏, 季莹, 吴凯华. 乙型肝炎病毒宫内感染免疫失败机制的探讨[J]. 实用妇产科杂志 2010; (08): 625-8.

[23]汪波, 高怡, 郭珍, et al. 乙型肝炎病毒宫内感染新生儿外周血T细胞亚群表达[J]. 中国药物与临床 2014; (07): 865-6.

[24]杜二球, 郑九生. 新生儿HBV宫内感染脐血T淋巴细胞亚群的特点[J]. 江西医学院学报 2009; (02): 55-7.

[25]陈旭芳, 贾廷珍. 脐血淋巴细胞免疫学特性研究[J]. 免疫学杂志 1998; (02): 70.