HPLC法分析进口啤酒中组胺和酪胺的污染水平

Analysis of contamination levels of histamine and tyramine in imported beer by HPLC

杨春梅    廖俊林  吴宇   李秉成   王峻

(成都产品质量检验研究院有限责任公司，四川  成都  610000)

摘要：研究建立一种检测啤酒中组胺和酪胺的高效液相色谱法，对四川省内消费的部分进口啤酒中组胺和酪胺的污染情况进行分析。结果显示：进口啤酒中组胺的含量低于2mg/L，酪胺参照10mg/L的有毒界限水平，仅1个啤酒样品的含量为12.507mg/L，其他样品的酪胺含量低于10mg/L，说明在川内销售的进口啤酒中组胺和酪胺污染水平较低，具有良好的安全性。

关键词：进口啤酒  组胺   酪胺  高效液相色谱法   

生物胺是一类低分子质量含氮碱性有机化合物，具有特定的生物活性。生物胺广泛存在于葡萄酒、啤酒、发酵肉制品等发酵食品中^[1]。根据结构可把生物胺分为三类:脂肪族(腐胺、尸胺)、芳香族（酪胺）和杂环族（组胺），脂肪族生物胺的产生于卫生条件密切相关，而芳香族和杂环族生物胺被认为具有毒性作用^[2]。生物胺中的组胺和酪胺作为一类有毒物质在摄入过量时有一定危害。对于高血压患者四小时内摄入6mg的酪胺或者啤酒中酪胺含量大于10mg/L，都被认为是危险的^[3]；而组胺可导致食源性中毒，造成腹部痉挛、呕吐和腹泻。目前一些葡萄酒生产国对葡萄酒中中组胺的含量做出了规定：德国≤2mg/L，比利时≤5~6mg/L，瑞士和澳大利亚≤10 mg/L，法国≤8 mg/L，荷兰≤3mg/L^[1]。但对其他饮用酒中组胺未做相关规定。同时，所有饮料酒中的酪胺的限量要求也未见报道。

美国^[4]、巴西、欧洲对其啤酒中的生物胺均有报道，同时在四川省内销售的进口啤酒数量较多， 为了对四川省内销售的进口啤酒中组胺和酪胺含量有一个初步的了解，本文拟采用丹磺酰氯为衍生试剂，C₁₈色谱柱进行分离，用HPLC法测定四川省内销售的来自19个不同国家的不同品牌的200批次啤酒中组胺和酪胺的含量，为研究制定啤酒中组胺和酪胺限量标准提供基础依据，为进一步保障食品安全提供技术依据。

1.材料与方法

1.1实验材料

    进口啤酒样品：市场购买

仪器与设备：高效液相色谱仪（HPLC）：Agilent 1260，配有二极管阵列检测器；恒温水浴锅，涡旋振荡器，氮吹仪等。

主要化学试剂：组胺标准品（纯度＞99%），酪胺标准品（纯度＞99%），丹磺酰氯（衍生试剂，纯度＞99%），1,7-二氨基庚烷（内标物，纯度＞99%），丙酮（色谱纯），0.1mol/L的盐酸，饱和碳酸氢钠，1mol/L的氢氧化钠，乙醚等。

1.3标准溶液的配制

准确称取适量的组胺和酪胺标准品，用0.1mol/L的盐酸溶解并定容配制成浓度为50mg/L的储备液，然后再分别移取一定量的储备液用0.1mol/L的盐酸稀释并定容成浓度为0.05 mg/L、0.25 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L的标准溶液。

1.4实验方法

样品的前处理，样品及标准品的衍生方法参照参照GB 5009.208-2016《食品安全国家标准  食品中生物胺的测定》^[5]。

1.5 液相色谱分析

1.5.1 色谱条件

Agilent zorbas sb-C₁₈ 色谱柱（5um，4.6×250mm）；柱温：35℃；流速：0.8mL/min;进样量：20uL；检测波长：254nm;流动相的梯度洗脱程序见表1。

表1  梯度洗脱程序表

注：流动相A:90%乙腈+10% 0.01molg/L乙酸铵；

流动相B：10%乙腈+90% 0.01molg/L乙酸铵

1.5.2 液相色谱分析

    分别将衍生后的标准溶液、样品溶液根据设定的色谱条件进行液相色谱分析，用内标法进行定量分析。

2.结果与讨论

2.1组胺和酪胺的方法学验证

图1   组胺和酪胺HPLC图

图2    组胺和酪胺的光谱扫描图

从图1可以看出：各组分峰在实验室条件下能被有效分离，经图2的光谱扫描图确认： t=8.786min和t=14.352min的峰分别为组胺和酪胺。

表2  组胺和酪胺线性范围及回收率

从表2看出：组胺和酪胺在浓度0.05～20mg mg.L^-1范围内呈良好的线性相关性，当以啤酒为基质，加入1mL 浓度均为2mg/L的组胺和酪胺时，回收率分别为98.5%和95.7%，

2.2啤酒样品测定结果

本次试验的样品共测定了包括德国、比利时、丹麦、韩国等不同19个国家的啤酒，共200个样品，结果见表3。

表3   样品中组胺和酪胺含量

注：1）括号内的数字为样品个数，   2）N.D.代表测定值低于检测限。

从表3可以看出，200批次的进口啤酒中检出组胺的共有27组，组胺的检出率为13.5%，含量在0.1130～0.769 mg/L之间。200批次进口啤酒中检出酪胺的共有56组，酪胺的检出率为28%，含量在0.153～12.507mg/L之间。从检测结果来看，组胺检出率较低，且检测值均较小，如参照葡萄酒中的组胺2mg/L的限量标准，所测的200个啤酒样品中的组胺含量均低于限量标准。同时，酪胺的检出率高于组胺，检测值也大于组胺，说明进口啤酒中的酪胺含量大于组胺的含量，参照10mg/L的有毒界限水平，仅1个啤酒样品的含量为12.507mg/L。已超过有毒界限水平。

3.结论

四川省售的19个不同国家200批次啤酒中检出部分组胺和酪胺，从检测的结果来看， 仅1个样品的酪胺含量超过有毒界限水平，可见，在四川省消费市场内的进口啤酒具有良好的生物胺饮用安全性。

参考文献

[1] 李志军,钟其顶，邢江涛,等.国内消费市场葡萄酒与啤酒中生物胺污染水平的分析[J].中国食品学报,2013,13(6):191-197.

[2] 张敬,赵树欣,薛洁,等.发酵型饮料酒中生物胺含量的调查与分析[J].分析与检测,2012,38(6):165-170.

[3]栾光辉,刘春凤,李崎.不同啤酒生物胺含量的比较[J].食品与发酵工业,2013,39(1):176-180.

[4] Cortacero-Ram Rez S,Arr Ez-Rom N D,Segura-CarreteroA,et al. Determination of biogenic amines in beers and brewing-process samples by capillary electrophoresis coupled to laser-induced fluorescence detection［J］.Food Chemistry,2007, 100( 1) : 383 -389.

[5] GB 5009.208-2016《食品安全国家标准  食品中生物胺的测定》[S].