miR-21对宫颈癌细胞体外生长、迁移及

调控ERK/MAPK通路的机制研究

夏红，褚桂芬，杨翔，杨丽，胡金霞

（1.广州市番禺中心医院妇科，广东广州 511400；2. 滨州医学院生物化学与分子生物学教研室，山东烟台 264003 ）

文章已被现代妇产科进展杂志社录用，现代妇产科进展杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/xiandaifuchankejinzhan

【摘要】 目的 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌Siha细胞体外生长、侵袭迁移及调控ERK/MAPK通路的机制研究。方法 采用LipofectamineTM2000 脂质体法将miR-21模拟物(minic-21组)、模拟物对照寡核苷酸(minic-nc组)、抑制剂(inhibitor-21组)和抑制物对照寡核苷酸(inhibitor-nc组)转染到人宫颈癌Si ha细胞。转染48h 后，采用集落形成实验观察细胞生长，Trans well法检测细胞迁移及侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot检测各组细胞中ERK /MAPK信号通路蛋白的表达。结果 与相应对照组比较，minic-21组Si ha细胞的克隆集落数明显增多（P＜0.01），inhibitor-21组克隆集落数明显减少（P＜0.01）。minic--21组细胞体外迁移及侵袭能力均明显提高（P＜0.01），inhibitor-21组的细胞迁移及侵袭能力明显降低（P＜0.01）。minic-21组细胞增殖率升高而凋亡率降低（P＜0.05），inhibitor-21组细胞增殖率降低而凋亡率升高（P＜0.05）。Western blot检测显示，minic-21能明显上调RSK、MSK、RAF、MEK和MAPK的表达（P＜0.05），inhibitor-21能明显下调RSK、MSK、RAF、MEK和MAPK的表达（P＜0.05）。结论  改变miR-21的表达可影响Si ha细胞体外生长和侵袭迁移能力，可能与调控ERK/MAPK信号通路的激活有关。

【关键词】 微小RNA-21；宫颈癌；迁移；侵袭；ERK /MAP通路；

Effect of micro RNA-21on growth、migration and ERK/MAPK signaling pathway of cervical cancer cell line Si ha*. Xia Hong¹, Chu Guifen^1**, Yang Xiang¹, Yang Li¹, Hu Jinxia². 1. Department of Gynecology, PanYu central hospital, GuangZhou 511400; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University, Shandong Yantai 24002

【Abstract】 Objective To explore the role of micro RNA-21 (miR-21) on the growth、migration and invasion of cervical cancer cell line Si ha and its targeting regulation of ERK /MAP signaling pathway．Methods  Lipofectamine TM 2000 liposome was used to transfect miR-21 minic (minic-21 group)、minic oligonucleotides (minic-nc group)、inhibitor (inhibitor-21 group) and inhibitor oligonucleotides (inhibitor-nc group) into human cervical cancer Si ha cells．At 48 h after transfection, the cell proliferation, cell cycle and migration ability of the cells were detected by colony-forming experiment and Trans well test, respectively．The cell apoptosis was examined with AnnexinⅤ---FITC / PI double staining via flow cytometry. Western blot was used to detect the changes of RSK、MSK、RAF、MEK and MAPK proteins in ERK /MAP signaling pathway．Results   Compared with the corresponding contrast group, cell colony formation significantly increased in mimic-21 group. The cell colony formation significantly reduced in inhibitor-21 group. The difference was statistically significant (P＜0. 01). The number of migration cells and invasion cells in minic-21 group were obviously more than those in minic-nc group(P＜0.01).The number of migration cells and invasion cells in inhibitor-21 group were obviously less than those in inhibitor-nc group(P＜0.01). Compared with the control group，the apoptotic rate decreased in minic-21 group. However, the apoptotic rate increases were observed in the inhibitor-21 group, ^* the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the minic-nc group, minic-21广东省医学科研基金项目（No: A2016294）；国家自然科学基金（No: 81502536）

^** 通讯作者 Email:18926210318@qq.com

can up-regulate the expression of RSK、MSK、RAF、MEK and MAPK(P＜0. 05). Inhibitor-21 can down-regulate the expression of RSK、MSK、RAF、MEK and MAPK(P＜0. 05).  Conclusions  Altered expression of miR-21 can affect the growth and migration of Si ha cells. It may be related to the targeting regulation of ERK /MAP signaling pathway.

【Key words】Micro RNA ( miR-21) ; Cervical cancer; Migration; Invasion; ERK /MAP signaling pathway

前言

宫颈癌是世界女性中最常发生的恶性肿瘤之一，是发展中国家女性第二大诊断癌症和癌症死亡的第三大原因^[1]。肿瘤转移是导致宫颈癌患者术后复发以及死亡的主要原因。miR-21是一种常见的肿瘤相关性mi RNA，几乎参与了所有恶性肿瘤的发生及转移等^[2-3]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen active protein kinase，MAPK）是生物体内最重要的信号转导系统之一^[4]。细胞外信号调节激酶( extracellular signal－regulated kinase，ERK) 信号转导通路被认为是经典的MAPK通路，参与广泛的生理和病理过程^[5]。在宫颈癌中，有关miR-21对ERK /MAPK通路的分子调控机制罕见报道。因此，对miR-21及MAPK信号通路深入研究，有助于进一步了解宫颈癌的发病机制，对宫颈癌生物基因治疗新靶标具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂  人宫颈癌Si ha细胞购自南京科佰生物科技有限公司，DMEM 培养基购自美国Hyclone公司，Lipo-fectamine 2000购自美国（invitrogen）英杰生命技术有限公司，RNA提取试剂盒购自广州易锦生物科技有限公司，Trizol 试剂购自日本宝生生物工程有限公司（大连），PCR所需引物购自上海吉玛制药技术有限公司，Trans well试剂盒购自美国康宁公司，MAPK 信号通路相关蛋白购自美国CST公司。BCA 蛋白定量试剂盒和HRP-羊抗兔IgG购自碧云天生物科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、分组及转染  将宫颈癌Siha细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，当细胞密度达80%左右进行转染，细胞在转染前一天按2.0ｘ10⁵接种于６孔板中。采用Lipofectamine2000脂质体法将miR-21模拟物（minics）、模拟物对照寡核苷酸、抑制剂(inhibitor)和抑制剂对照寡核苷酸转染至人宫颈癌Siha细胞并分为minic-21组、minic-nc组、inhibitor-21组和inhibitor-nc组。转染过程严格按照试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，转染后将细胞置于恒温培养箱中继续培养 48 h 进行后续实验。

1.2.2 实时定量PCR( Quantitative real-time reverse transcription PCR，QPCR)检测mi R-21水平  按照Trilzol试剂使用说明书提取细胞总RNA，超微量分光光度计对RNA浓度和纯度进行检测。按反转录试剂盒说明书采用特异性反转录引物反转录为cDNA，以 cDNA 为模板，以U6为内参。MiR-21引物货号：上游HmiRQP0316，下游：QP010-03。扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s扩增40个循环。反应结束后采用2-△△Ct法计算mi R-21的相对表达。

1.2.3 集落形成实验  转染48ｈ后，胰酶消化，重悬细胞并计数，以400个/孔的密度接种于6孔培养板上，培养箱内连续培养7-14ｄ(每3天更新培养基1次)，采用结晶紫染色法固定染。 

1.2.4 Trans well 分析细胞迁移  细胞转染48h，将细胞饥饿12h后制备细胞混悬液，并在无血清培养基中调整细胞密度为1×10⁵/ml，然后将细胞悬液加入到Trans well 的上室中，下室中加入含10% 胎牛血清的培养基。37℃培养，细胞侵袭24h，取出小室，将Trans well小室基底膜完整切除，用无菌棉签擦去上室内细胞，多聚甲醛固定15min，苏木精染色10 min，显微镜下随机取10视野计数细胞迁移数，取平均值。

1.2.5 Trans well 分析细胞侵袭  用包被Matrigel胶的Trans well小室，在小室中加入500μＬ浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，调整细胞浓度为5×10^４/ml，余步骤同细胞迁移实验。显微镜下随机取6个视野计数细胞侵袭数目，取平均值。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡  采用流式细胞术联合 Annexin Ⅴ-FITC /PI 双染法检测凋亡率。细胞分组同上，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化各组细胞并得到单细胞悬液，PBS洗涤2次后，收集( 1～5)×10⁵个细胞，加入 500 μL Binding buffer重悬细胞，之后分别加入 5μL AnnexinⅤ-FITC 及 5 μL PI 混匀，室温避光反应 15 min，流式细胞术检测细胞凋亡，具体操作步骤按说明书进行。

1.2.7 Western blot检测ERK/MAPK通路蛋白的表达  转染48ｈ后，收集细胞，用PBS3次，然后加入已添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解后提取总蛋白。等量的蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，然后转至 PVDF 膜。用 5% 的 BSA 进行封闭后，依次孵育一抗和二抗，最后进行显影拍照。

1.3 统计学方法  实验所得统计数据用均数±标准差（`x±ｓ）表示，SPSS 13.0软件以ANOVA（one-way analysis of variance）法分析组间统计学差异，P<0.05则认为有统计学显著性差异、P<0.01则认为有统计学非常显著性差异；并用Graph Pad Prism 5软件作图。

2 结果 

2.1  改变miR-21表达对宫颈癌Siha细胞集落形成的影响  转染48h后，mimic-21组Si ha细胞的克隆集落数(585.30±16.95)较minic-nc组（399.30±15.60）明显增多(P<0.01)；inhibitor-21组Si ha细胞的集落数（269.30±9.53）较inhibitor-nc组（393.00±13.61）明显减少(P<0.01)。见图1。

图1 改变miＲ-21表达对Si ha细胞集落形成能力的影响 

**：与相应对照组相比，P＜0.01

2.2 改变miR-21表达对人宫颈癌Si ha细胞迁移及侵袭能力的影响Trans well实验检测各组Si ha细胞的体外迁移及侵袭能力，结果证实minic--21组Si ha细胞体外迁移及侵袭能力较minic—nc组均明显提高（p＜0.01），inhibitor-21组Si ha细胞迁移及侵袭能力较inhibitor-nc组明显降低（P＜0.01）。见表1，图2，图3，图4。

表1  MiR-21对Si ha细胞迁移及侵袭能力的影响（`x±s）

图2 改变miR-21表达对Si Ha细胞体外迁移及侵袭能力的影响（A 迁移， B 侵袭）

***：与相应对照组相比，P＜0.01

图 3 各组Trans well小室转染miR-21后细胞迁移图（光学显微镜，×10）

图 4 各组Trans well小室转染miR-21后细胞侵袭图（光学显微镜，×100）

2.3 改变miR-21表达对宫颈癌Si ha细胞凋亡的影响  采用 Annexin -FITC /PI双染法检测Si ha细胞的凋亡率。转染48 h后，minic-21组细胞凋亡率(16.55±0.05) %明显低于minic-nc组(31.00±1.800) %，inhibitor-21组转细胞凋亡率为(68.60±1. 90) %高于inhibito-nc组的( 47.10±2.60) %，差异均有统计学意义(P<0. 05)。见图5。

图5  改变miR-21表达对Si ha细胞凋亡率的影响

*：与相应对照组相比，P＜0.05

2.4 改变miR-21 表达对Si ha 细胞ERK/MAPK表达的影响   采用Western blot检测ERK/MAPK通路中相关蛋白的表达，minic-21组较minic-nc组能明显上调RSK、MSK、RAF、MEK和MAPK的表达，inhibitor-21组较inhibitor-nc组能明显下调RSK、MSK、RAF、MEK和MAPK的表达，差异均有统计学意义(P＜0. 05)。见表3，图6。

表2 改变miR-21表达对各组细胞ERK/MAPK信号通路蛋白的影响（`x±s）

*：与相应对照组相比，P＜0.05

图6  改变miR-21表达对各组细胞ERK/MAPK信号通路蛋白的影响

3 讨论

宫颈癌的发生转移机制非常复杂，涉及多种癌基因、抑癌基因和信号转导通路的改变，然而具体的分子调控机制仍有待进一步探讨。Mi RNA自1933年被发现以来，一直是肿瘤领域研究的热点^[6-7]。研究发现^[8-9]，mi RNA分子表达谱的变化与肿瘤的发生发展密切相关，改变肿瘤组织细胞中特定mi RNA分子的表达水平可能是肿瘤基因治疗新靶标开发的重要补充。

mi R-21是一种具有癌基因特性的促癌mi RNA，是肿瘤发生、发展中的重要调控因素^[10-11]，而是否参与宫颈癌的生长及转移尚无确切的证据。Jiang等^[12]报道，过表达的mi R-21能增强肝癌干细胞的表型，促进肝细胞癌的侵袭。Yang等^[13]报道，过表达mi R-21可靶向和抑制肿瘤抑制基因PTEN表达，从而促进前列腺癌细胞PC-3的增殖和侵袭。miR-21在肾癌Caki-1细胞中高表达，其通过下调TCF-21的表达水平，从而抑制KISS 1基因表达，增加肾癌细胞侵袭力^[14]。

本研究中，我们首先将miR-21的mimics及inhibitor转染至Si ha细胞，通过调节miR-21的表达水平，利用集落形成实验观察细胞的生长，Trans well法检测细胞迁移及侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，western blot检测ERK/MAPK信号通路蛋白表达的变化。结果显示转染miR-21 mimics后，Si ha细胞的生长能力明显增强（P＜0.01），细胞迁移及侵袭能力增强（P＜0.01），凋亡能力下降（P＜0.05），与minic-nc组比较差异均有统计学意义。转染miR-21 inhibitor后细胞生长受到抑制（P＜0.01）， 迁移及侵袭能力减弱（P＜0.01），凋亡能力增强（P＜0.05），与inhibitor-nc组比较差异均有统计学意义。说明miR-21可能通过促进宫颈癌细胞生长，增强迁移及侵袭能力，在宫颈癌发生发展中发挥癌基因的作用。这与既往研究结论一致。

众所周知，MAPK 信号通路具有重要的生物学功能，在许多肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移等过程中起重要调节作用^[15]。ERK 信号通路被认为是经典的 MAPK通路。其活化过程是通过Ras→Raf→MEK通路作用于ERK，活化的ERK作用于某些关键的调控因子，从而起到调节细胞周期，调控细胞的增殖、分化、凋亡和转移等作用^[16-18]。据报道许多mi RNA是通过MAPK信号通路来发挥其功能^[19]。研究证实，miR-378在心肌细胞中过度表达，可通过抑制RAS-MAPK信号通路来抑制心肌细胞增殖^[20]。过表达miR-126可通过调节ERK/MAPK信号通路促进间质干细胞向内皮细胞分化^[21]。动脉粥样硬化中miR-136可通过ERK 1 /2MAPK 通路调节血管平滑肌细胞增殖^[22]。Li 等^[23]发现 miＲ-181b 可通过调节 p-ERK 1/2平衡来调控血管平滑肌细胞增殖。牛晓兵^[24]研究表明，miR-143可通过调节KRAS、p-ERK1/2和细胞周期蛋白D1的表达抑制RAS-MAPK信号通路激活，从而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁徙。

本文结果显示，转染miR-21 minic后，ERK通路中P-RSK、P-MSK、P-RAF、P-MEK和P-MAPK的相对蛋白表达量明显升高，相反转染miR-21 inhibitor后，ERK通路中的上述蛋白的相对蛋白表达量明显降低，与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0. 05)。据此推测，mi R-21可能通过对ERK/MAPK 信号通路的调节来影响人宫颈癌Si ha细胞的生长和迁移。 

本研究有两点不足：一、未使用ERK/MAPK 通路抑制剂验证逆转mi R-21过表达对人宫颈癌细胞生长和迁移的促进效应；二、未通过动物模型对miR-21在宫颈癌发生发展中的作用进行体内研究。后续我们将通过相关实验验证并进一步阐明。综上所述，改变miR-21的表达可影响Si ha细胞体外生长和迁移能力，可能与调控ERK/MAPK信号通路的激活有关。

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