比较两种方法在检测双氢青蒿素抗菌活性实验中的灵敏性

黄梅1,2, 沈建英2 ,杜成成1,2，谭余庆2, 罗俊1*，

（1，贵州医科大学基础医学院，贵州 550000）

 （2，中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

[摘要]：目的：比较肉汤稀释法和平皿打孔法在检测双氢青蒿素抗菌活性实验中的灵敏性，明确这两种方法的区别，为人们在进行抗菌活性实验筛选时选取有效的方法提供参考。方法：本实验选取革兰阴性菌（大肠埃希氏菌）和革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）。分别采用肉汤稀释法和平皿打孔法检测了双氢青蒿素在8 h、16 h、24 h、32 h这四个时间点的抗菌效果。为了确认结论，我们还比较了两种方法在检测两种抗菌阳性药物（链霉素和青霉素）的实验中的灵敏性。结果：用肉汤稀释法检测发现双氢青蒿素在剂量为1.23 μM时对大肠埃希氏菌显示出抑菌效果。用平皿打孔法检测发现，双氢青蒿素在相同浓度时无抑菌圈出现，当将浓度增大到5 mM时才显示出抑菌圈；而链霉素用肉汤稀释法检测时在3.7 μM对大肠埃希氏菌显示出抗菌结果，平皿打孔法时100 μM时才出现明显抑菌圈。结论：在检测抗菌活性实验中，肉汤稀释法比平皿打孔法更灵敏。

[关键词]：双氢青蒿素；抗菌实验；肉汤稀释法；平皿打孔法 

Compare of Two Methods to Study the Antibacterial Activity of Dihydroartemisinin

Mei Huang1,2, Jianying Shen2, Chengcheng Du1, 2, Yuqing Tan2, Jun Luo1, *,

(1,School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guizhou 550000, China)

 (2,Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

[Abstract]: Objective: To compare the sensitivity of the broth dilution method and plate punching method in the detection of the antibacterial activity of dihydroartemisinin. Methods: Gram-negative bacteria (Escherichia coli) and Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus) were selected in these experiments. The antibacterial effects of dihydroartemisinin and two antibacterial positive drugs (streptomycin and penicillin) at four time points of 8 h, 16 h, 24 h and 32 h were detected by broth dilution method and plate punching method.To confirm the conclusion, we also compared the sensitivity of the two methods in the experiments to detect two antibacterial positive drugs (streptomycin and penicillin). Results: Dihydroartemisinin showed a bacteriostatic effect on E. coli at a dose of 1.23 μM, detected by broth dilution method. However, using plate punching method, no inhibition zone was detected at the same concentration. Dihydroartemisinin showed a inhibition zone when its concentration was up to 5 mM；Streptomycin showed an antibacterial effect on Escherichia coli at 3.7μM when tested by broth dilution method, and a significant inhibition zone appeared at 100μM in the plate punching method. Conclusion: In the experiment of detecting the antibacterial activity, the broth dilution method is more sensitive than plate punching method

[Key words]: dihydroartemisinin; antibacterial test; broth dilution method; plate punching method

抗菌活性筛选实验常用的方法有抑菌圈法、菌落计数法、最低抑菌浓度法和菌落计数法等^[1]。而肉汤稀释法属于最低抑菌浓度法，平皿打孔法属于抑菌圈法，抑菌圈法又称扩散法。肉汤稀释法是指用M-H肉汤将抗菌药物做不同浓度的稀释后，再接种待测菌，显微镜下观察以完全抑制细菌生长的最低药物浓度MIC 并结合酶标仪测定OD₆₀₀，通过酶标仪在600 nm波长处定量测定抗菌药物的抗菌效果。此法可以准确测定MIC和MBC值，节省试剂和材料且操作方便等。但此法难以用肉眼判断96孔板是否污染杂菌。而平皿打孔法药物是随琼脂扩散形成不同浓度梯度的含药区域，由于不同细菌对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性不同，因而形成一定大小的抑菌圈，根据抑菌圈大小，可以判断药物的抗菌效果强弱或是细菌对试验药物的敏感性。其操作便捷、简单易性、成本低廉，结果准确可靠，是抑菌试验初筛选用的常用方法。但药物的扩散性对抑菌圈影响较大、接种菌量和制琼脂厚度均等都会影响其抑菌圈大小^[2-3]。

   青蒿素是从中药植物黄花蒿中提取的含有过氧基团的倍半萜内酯 (药用植物的生物活性组分) 药物。 双氢青蒿素是青蒿素经硼氢化钠还原得到的化合物， 为青蒿素主要的衍生物之一。 目前青蒿素及其衍生物虽然有较多的抑菌活性报道^[4-13]，但是我们发现青蒿素及其不同衍生物的抗菌活性报道有很大差别，这种差别可能是化合物本身引起的，也可能是不用的实验室采用不用的实验方法、实验条件引起的。

因此本研究采用常用抑菌筛选方法----肉汤稀释法和平皿打孔法来检测青蒿素的衍生物双氢青蒿素的抑菌活性，比较这两种方法的灵敏性。为了确认结论，我们还比较了两种方法在检测两种抗菌阳性药物（链霉素和青霉素）的实验中的灵敏性。我们的实验证明，在检测抗菌活性实验中，肉汤稀释法比平皿打孔法更灵敏。 该研究结果为人们在进行抑菌活性实验筛选时选取有效的方法提供了参考。

1.材料与方法

材料

1.1.1实验菌株

大肠埃希菌CMCC(B)44102 (中国食品药品鉴定研究院，批号：5a30-2)

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 (中国食品药品鉴定研究院，批号：3a26-1)

1.1.2 主要实验试剂

LB培养基（上海基实业有限公司，批号：20180316001）、M-H肉汤培养基（上海基实业有限公司，批号：20180123001）、M-H琼脂（上海基实业有限公司，批号：20180223001）、琼脂粉（上海源叶生物科技有限公司，批号 ：P25D8G51085）、双氢青蒿素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：S-012-170426）、青霉素（北京索莱宝科技有限公司，批号：1111H051）、硫酸链霉素（北京索莱宝科技有限公司，批号：619C021）、0.9 %生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：1612173206）等。

1.1.3 主要仪器

台式恒温振荡器 (上海龙跃仪器设备有限公司，批号：03231801)、细菌浊度仪（上海昕瑞仪器仪表有限公司，批号：1801021）、酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司，批号：51119080）、恒温培养箱（日本三洋，批号：MCO-15AC）、超净台（苏州净化设备有限公司，批号：SW-CJ-2FD）、灭菌蒸汽高压锅（施都凯仪器设备有限公司，批号：MJ-54A）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，批号：32890907）、游标卡尺、三角瓶等。

1.2方法

采用肉汤稀释法和平皿打孔法，选取革兰氏阴性菌（大肠埃希氏菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）对药物进行实验。

1.2.1菌悬液制备

将保存菌种接种于M-H肉汤中，置于37℃恒温振动培养箱中复活6~8 h（对数期），接种在M-H琼脂平板上，平板划线后倒置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。挑取3~5个典型菌落于装有0.9 %生理盐水的玻璃瓶中，调整浑浊度至0.5麦氏比浊度 (约1.5x10⁸ CFU/ml)备用。

1.2.2肉汤稀释法测半数抑菌浓度（IC₅₀）^[14-15]

取无菌96孔板，分别于每一排的第2孔加入药物150 μl，其余各孔均加入M-H肉汤100 μl，于第2孔取出药液50 μl加入第3孔中，充分混匀后再从第3孔取50 μl 于第4孔。以此类推，第9孔时充分混匀后吸50 μl丢弃。第10孔不加药液，作为阴性对照。每孔三个复孔。将稀释至0.5麦氏比浊度的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌悬液再稀释100倍，并分别加入加了药液的96孔板，每孔浓度100 μl，使最终菌液浓度为5x10⁵ CFU。双氢青蒿素每排药液的最终浓度为：300 μM、100 μM、33.3 μM、11.1 μM、3.7 μM、1.23 μM、0.41 M、0.14 μM、0 μM。而硫酸链霉素与青霉素的最终浓度为：100 μM、33.3 μM、11.1 μM、3.7 μM、1.23 μM、0.41 μM、0.14 μM、0 μM，放入37 ℃恒温培养箱培养，在8 h、16 h、24 h、32 h时间点时于600 nm测量OD值，计算其抑菌率及IC₅₀。

抑菌率（%）=（DO_{对照菌浓度}-DO_{含药菌浓度}）×100% / DO_{对照菌浓度}

1.2.3平板打孔法

制平板：称取M-H琼脂培养基，按比例加入双蒸水，溶解后，121 ℃高压灭菌，待温度降为60 ℃制平板，每个培养皿加入15ml 培养基，待其冷却凝固后放入4 ℃冰箱备用。

用灭菌棉签在平板上均匀涂布已制备好的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的菌液，然后用直径为4 mm的无菌圆形打孔器打孔，打孔后挑去孔中的培养基块，每个平皿7个孔。双氢青蒿素浓度分别为：5 mM、1 mM、200 μM、40 μM、8 μM、1.6 μM、0 μM等7个浓度。青霉素和硫酸链霉素浓度为：100 μM、33.3 μM、11.1 μM、 3.7 μM、 1.23 μM、0.14 μM。每孔加入药量50 μl。再将培养皿置于 37 ℃恒温烘箱中培养，分别在8 h、16 h、24 h、32 h时间点取出已培养好的平板拍照，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径，用游标卡尺，采用十字交叉法测量抑菌圈直径平均值并记录结果，根据抑菌圈大小判断药物对细菌的敏感程度。根据药理学试验方法0 mm不敏，抑菌圈 <10 mm的为低敏，10 mm-14mm的为中敏，15 mm-20 mm为高敏，20 mm以上为极敏来判断^[16-17]。

2.结果

2.1 双氢青蒿素抗大肠埃希氏菌的结果

我们用平皿打孔法和肉汤稀释法检测了双氢青蒿素对大肠埃希氏菌作用不用时间后的抗菌效果。

从平皿打孔法结果(Fig.1a)可以看出，大肠埃希氏菌在培养8 h 后才有明显生长。双氢青蒿素只有在浓度为5 mM时对大肠埃希氏菌显示出抑菌圈(10.32±0.06 mm)，其余浓度均无抑菌圈出现。随着时间的延长，抑菌圈会变小。从四个时间点可以看出，16 h抑菌圈最明显(10.19±0.06 mm)，32 h慢慢有细菌长出，抑菌圈相应变小(8.62±0.15 mm )。

从肉汤稀释法结果(Fig. 1b和Fig. 1c)可以看出，双氢青蒿素在浓度为1.23 μM作用32 h仍显示出抗菌效果（25.2 %），且随着浓度的增加，抑菌效果更明显。双氢青蒿素作用大肠埃希氏菌8 h、16 h、24 h和32 h的IC₅₀ 分别为250.1 μM、128.6 μM、155.9 μM和221.9 μM (Fig. 1c)。 

结果表明，在双氢青蒿素抗大肠埃希氏菌的检测实验中，肉汤稀释法比平皿打孔法更敏感。同时我们的结果提示，用两种方法检测双氢青蒿素抗大肠埃希氏菌抗菌实验在16-24 h 内检测效果较好，延长检测时间，抗菌效果下降，这可能与药物的稳定性有关。 

2.2 双氢青蒿素抗金黄色葡萄球菌的结果

我们采用与抗大肠埃希氏菌相同的药物浓度和检测时间点检测双氢青蒿素对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。从平皿打孔法结果（Fig. 1d）可以看出，双氢青蒿素对金黄色葡萄球菌均未显示出抑菌效果。肉汤稀释法结果（Data not shown）同样显示双氢青蒿素对金黄色葡萄球菌均未显示出抑菌效果。说明该实验条件下， 金黄色葡萄球菌对双氢青蒿素并不敏感。

图1，用两种方法检测双氢青蒿素的抗菌活性 

Figure 1. Two methods for detecting the antibacterial activity of dihydroartemisinin

2.3链霉素抗大肠埃希氏菌的结果

为了确认肉汤稀释法比平皿打孔法更灵敏的结论，我们用平皿打孔法和肉汤稀释法检测了链霉素对大肠埃希氏菌作用不用时间后的抗菌效果。

从平皿打孔法结果(Fig.2a)可以看出，100 μM、33.3 μM的链霉素在作用16 h、24 h和32 h时有抑菌圈出现，分别为14.75±0.05 mm、14.25±0.09 mm、14.23±0.11 mm 和7.71±0.03 mm、7.76±0.02 mm、7.21±0.04mm；而其余浓度均没有出现抑菌圈。随着时间的延长，32 h可以看出抑菌圈周边有细菌长出；与16 h和24 h相比，抑菌圈没有之前明显。

用肉汤稀释法筛选时，链霉素在3.7 μM仍显示出抗菌效果，浓度越大，抗菌效果越强。在浓度为100 μM时，抑制率达到80%以上（Fig 2b）。链霉素作用大肠埃希氏菌8 h、16 h、24 h和32 h的IC₅₀ 分别为9.8 μM、12.4 μM、15.4 μM和18.1 μM (Fig. 2c)。 

结果表明，在链霉素抗大肠埃希氏菌的检测实验中，肉汤稀释法比平皿打孔法更敏感。

图2，用两种方法检测链霉素抗大肠埃希氏菌的活性

Figure 2. Two methods for detecting the activity of streptomycin against Escherichia coli

2.4 青霉素抗金黄色葡萄球菌的结果

为了进一步确认肉汤稀释法比平皿打孔法更灵敏的结论，我们用平皿打孔法和肉汤稀释法检测了青霉素对金黄色葡萄球菌作用不用时间后的抗菌效果。

从平皿打孔法结果(Fig.3a)可以看出，金黄色葡萄球菌在培养8 h尚未明显生长。在16 h, 24 h 和32 h， 除空白对照外的其余各浓度药物均呈现明显抑菌圈。

从肉汤稀释法结果(Fig. 3b)可以看出，肉汤稀释法对青霉素抗菌效果达到80%以上，浓度越大抑菌效果越明显。青霉素作用金黄色葡萄球菌8 h、16 h、24 h和32 h的IC₅₀ 分别为5.5 μM、3.0 μM、1.4 μM和1.5 μM（Fig. 3c）。从IC₅₀ 中可以看出，随着时间的延长，青霉素对金黄色葡萄球菌的半数抑菌浓度成递降趋势 (Fig. 3c)。 

图3，用两种方法检测青霉素抗金黄色葡萄球菌的活性

 Figure 3. Two methods for detecting the activity of penicillin

against S.aureus

 3.结论：

在检测抗菌活性实验中，肉汤稀释法比平皿打孔法更灵敏。

4.讨论

4.1 本研究用两种不同的实验方法，检测双氢青蒿素对大肠埃希氏菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的抗菌活性，研究结果发现，双氢青蒿素对大肠埃希氏菌显示出抗菌作用，对金黄色葡萄球菌没有抗菌作用。

4.2肉汤稀释法和平皿打孔法都是常用的抗菌筛选方法，实验通过双氢青蒿素和阳性药（链霉素和青霉素）等药物，采用肉汤稀释法和平皿打孔法两种实验方法分别对比了大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抗菌作用。研究发现，对双氢青蒿素、链霉素和青霉素而言。相同药量时，肉汤稀释法的实验结果比平皿打孔法效果好。此结果与张濛等^[18]和 Luber^[19] 的研究发现一致。从实验结果我们可以得出，在多种抗菌筛选实验方法中，采用规范规定的不同实验方法得出的结果可能不相同。对于这两种筛选方法造成实验结果差异的原因是多方面的，主要有如下几个方面：

药物扩散力影响。平皿打孔法加入的药物是随琼脂扩散形成不同浓度梯度的含药区域，由于不同细菌对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性不同，因而形成一定大小的抑菌圈。药物扩散力强弱直接影响抑菌圈的大小。而肉汤稀释法直接与药物作用，药物扩散性对其没有影响。

平皿孔底是否封底影响。有文献报道^[1]-[3]，平皿打孔法采用0.95%琼脂封底或者是采用火焰封底的效果好于没有封底的。这可能是药物加入孔中部分会随皿底流失一部分，从而导致抗菌效果下降。而肉汤稀释法没有中间载体，直接在液体中反应，不存在药物流失问题，因而能较正确地反映药物实际的使用效果。

菌液量影响。涂菌量的多少也是影响因素之一。平皿打孔法涂菌时是一块平板，涂菌时重叠的部分菌液会比没有重叠的部分多。菌液浓度的多少也会造成影响。而肉汤稀释法将提前稀释好的菌液加入96孔板中，每个孔的菌液基本一致。

平板制备方法影响。目前制备实验平板的方法有涂布平板法、倾注平板法、预加菌液倾注平板法，有文献报道^[3]，预加菌液倾注平板法效果比涂布平板法和倾注平板法效果好。不同平板的制备方法也是影响因素之一。此外，不用的实验室采用不用的实验方法、实验条件也可能造成两种方法之间的差异。

4.3 有文献显示^[20]，筛选方法影响了抗菌活性结果。对于多个样本的初筛，建议采用平皿打孔法：1）操作简单：一个平板可以打多个孔，每孔可加入多个药物的不同浓度，操作比较简单； 2）效果直观：通过直接观察抑菌圈的大小，抑菌效果非常直观。但是当用平皿打孔法筛选往后，可采用肉汤稀释法在一定的浓度范围内进一步筛选，并确定药物的MIC。 肉汤稀释法已经成为最广泛的抗菌实验筛选方法。因此，当选用药物进行抗菌细筛时，建议采用肉汤稀释法。尤其需要注意的是，在初筛时，用平皿打孔法获得阴性结果时，可能用肉汤稀释法会出现阳性结果，因为后者比前者更灵敏。 

致谢本工作由中央级公益型科研院所基本科研业务费专项基金资助（资助编号：ZZ11-046）。

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