物理教学探讨稿件信息
桃红接骨合剂微生物方法适用性试验研究
杨焰明1 许建国2 许建斌3
1. 武汉市新洲区中医医院 湖北 武汉 新洲 430400
2. 武汉市新洲区中医骨伤专科医院 湖北 武汉 新洲 430400
3. 武汉市新洲区中医骨伤专科医院 湖北 武汉 新洲 430400
摘要：桃红接骨合剂为新洲区中医骨伤专科医院中药口服制剂，根据所附质量要求，应进行需氧菌数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌大肠埃希菌的检查。经实验研究，确认采用平皿法进行需氧菌数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌大肠埃希菌的检查。经对所采用的方法进行验证，符合2015版《四部药典》微生物限度检查法有关规定，方法可行。
关键词：桃红接骨合剂 微生物限度检查法 适用性试验 平皿法
1实验仪器、试液
1.1实验菌种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，白色念珠菌、黑曲霉
1.2培养基及稀释剂：
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液，胰酪大豆胨琼脂培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基。
1.3仪器
天平、培养箱、高压蒸汽灭菌锅，生物安全柜、净化工作台。
2 需氧菌、霉菌及酵母菌试验方法的建立及验证
2.1菌液制备
(1) 接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆液体培养基中30-35℃培养18-24小时，上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液10倍稀释法稀释至10-2～10-7制成每0.2ml含菌数为〈2000CFU的菌悬液备用。
(2) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中20-25℃培养2-3天，上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液10倍稀释法稀释至10-2～10-7制成每0.2ml含菌数为〈2000CFU的菌悬液备用。
(3) 取经在沙氏葡萄糖琼脂培养基上20-25℃培养5～7天的黑曲霉，加入3～5ml含0.05% (ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液，将孢子洗脱。再收集孢子悬液（用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌离心管中，用0.05% (ml/ml）聚山梨酯80 的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液10倍稀释法稀释，选择10-2～10-7稀释级进行菌落计数，制成每0.2ml含孢子数〈2000CFU的孢子悬液备用。
2.2供试液制备
取供试品10ml，用90 ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混匀，作为1:10供试液。
2.3需氧菌总数计数方法适用性试验
需氧菌总数计数方法验证实验分三组
(1) 试验组：取制备好的供试液20ml和〈2000cfu／0.2ml试验菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）混匀，取混合液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌平皿30-35℃倒置培养3天，白色念珠菌、黑曲霉试验菌平皿30-35℃倒置培养5天，计数。
(2) 供试品对照组：取制备好的供试液20ml和试验组菌液相同体积的稀释液混匀，取混合液1ml注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，平行制备2个平皿。30-35℃倒置培养3天，计数。
(3) 菌液对照组：取稀释液20ml和〈2000cfu／0.2ml试验菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）混匀，取混合液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌平皿30-35℃倒置培养3天，白色念珠菌、黑曲霉试验菌平皿30-35℃倒置培养5天，计数。
霉菌及酵母菌总数计数方法验证
(1) 试验组：取制备好的供试液20ml和〈2000cfu／0.2ml试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）混匀，取混合液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。20-25℃倒置培养5天，计数。
(2) 供试品对照组：取制备好的供试液20ml和试验组菌液相同体积的稀释液混匀，取混合液1ml注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿。20-25℃倒置培养5天，计数。
(3) 菌液对照组：取稀释液20ml和〈2000cfu／0.2ml试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）混匀，取混合液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。20-25℃倒置培养5天，计数。
试验组回收率： 试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数×100%
菌液对照组平均菌落数
标准：菌回收率均应在50%-200%的范围内。
桃红接骨合剂需氧菌总数计数验证试验结果
|
试验菌 |
供试品 |
菌落数（CFU/皿） |
试验组菌 回收率(%) |
|||||
|
试验组 |
供试品 对照组 |
菌液 对照组 |
||||||
|
金黄色葡萄球菌 （10-5） |
第一次实验(原级) （平均值） |
74 |
79 |
0 |
0 |
85 |
90 |
87.5% |
|
77 |
0 |
|||||||
|
第一次实验(1:10) （平均值） |
81 |
85 |
0 |
0 |
88 |
95.4% |
||
|
84 |
0 |
|||||||
|
第二次实验(原级) （平均值） |
78 |
82 |
0 |
0 |
89 |
95 |
86.9% |
|
|
80 |
0 |
|||||||
|
第二次实验(1:10) （平均值） |
82 |
88 |
0 |
0 |
92 |
92.3% |
||
|
85 |
0 |
|||||||
|
第三次实验(原级) （平均值） |
79 |
83 |
0 |
0 |
87 |
93 |
90.0% |
|
|
81 |
0 |
|||||||
|
第三次实验(1:10) （平均值） |
82 |
88 |
0 |
0 |
90 |
94.4% |
||
|
85 |
0 |
|||||||
结论：根据上述验证结果可知，该合剂用平皿法进行计数方法适用性实验时，用原级和（1:10）供试液进行需氧菌计数时，回收率均在50%-200%的范围内，说明该合剂可以用原级和（1:10）供试液进行需氧菌总数计数。
桃红接骨合剂需氧菌总数计数验证试验结果
|
试验菌 |
供试品 |
菌落数（CFU/皿） |
试验组菌 回收率(%) |
|||||
|
试验组 |
供试品 对照组 |
菌液 对照组 |
||||||
|
铜绿假单胞菌 （10-5） |
第一次实验(原级) （平均值） |
62 |
67 |
0 |
0 |
78 |
85 |
79.2% |
|
65 |
0 |
|||||||
|
第一次实验(1:10) （平均值） |
69 |
73 |
0 |
0 |
82 |
86.5% |
||
|
71 |
0 |
|||||||
|
第二次实验(原级) （平均值） |
61 |
68 |
0 |
0 |
76 |
80 |
83.3% |
|
|
65 |
0 |
|||||||
|
第二次实验(1:10) （平均值） |
68 |
75 |
0 |
0 |
78 |
92.3% |
||
|
72 |
0 |
|||||||
|
第三次实验(原级) （平均值） |
60 |
67 |
0 |
0 |
75 |
83 |
81.0% |
|
|
64 |
0 |
|||||||
|
第三次实验(1:10) （平均值） |
68 |
74 |
0 |
0 |
79 |
89.8% |
||
|
71 |
0 |
|||||||
结论：根据上述验证结果可知，该合剂用平皿法进行计数方法适用性实验时，用原级和（1:10）供试液进行需氧菌计数时，回收率均在50%-200%的范围内，说明该合剂可以用原级和（1:10）供试液进行需氧菌总数计数。
桃红接骨合剂需氧菌总数计数验证试验结果
