¹鸡源巴氏杆菌的分离鉴定

及致病性研究

秦晓冰

（青岛农业大学 山东省预防兽医学重点实验室 山东 青岛 266109）

摘 要：从青岛农业大学动物医院的蛋鸡送检病料中，无菌采集病死鸡肺脏、肝脏组织进行细菌的分离培养和鉴定，并对鉴定的分离菌进行药敏试验和致病性试验。结果表明：分离菌在血琼培养基上呈圆隆、露滴状、表面光滑带荧光的白色菌落，染色镜检为革兰氏阴性短杆菌，经PCR鉴定该菌为多杀性巴氏杆菌；该菌对氟苯尼考、阿米卡星高度敏感，对头孢曲松、头孢氨苄、阿莫西林等13种药物不同程度耐药；该菌对小鼠呈高致死性，表明该菌有很强的致病性。

关键词：鸡源多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；致病性

中图分类号: S831.7                 文献标识码:A         文章编号:

Isolation and identification of Pasteurella multocida from

Laying Hens and study on its pathogenicity

QIN Xiao-bing

(Shandong Key Laborary of Preventive Veterinary Medicine, Qingdao agricultural University, Qingdao, 266109, P.R China)

Abstract：Bacteria in the lungs and liver tissues of dead laying hens from the animal hospital of Qingdao Agricultural University were isolated, cultured and identified. Drug sensitivity test and pathogenicity test were carried out on the identified and isolated bacteria. The results showed that the isolated bacteria were round, dripping, smooth surface and white colonies with fluorescence on the blood-agar medium, and were Gram-negative small bacterium by staining and microscopic examination, and were identified as Pasteurella multocida by PCR. The isolated P.multocida strain was highly sensitive to Florfenicol and Amikacin, and had different levels of drug resistance to Ceftriaxone, Cephalexin, Amoxicillin and the other 10 drugs, Furthermore, was highly pathogenic to mice here.

Key words: P. multocida from laying hens；isolation and identification；pathogenicity

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属，是G^—性小杆菌^[1]。Pm引起鸡的出血性败血症，又称禽霍乱，是以病鸡出现肠道出血、败血症和关节炎为主要特征，发病率和死亡率都非常高的禽重要传染病之一^[2]。Pm存在于禽类的上呼吸

收稿日期

基金项目：山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心；山东省高等学校优势学科人才团队培育计划。

第一作者：秦晓冰(1971-  )，女，副教授，博士，主要从事动物传染病防治及生物制品的研发，Email:xiaobingqin@yeah.net

道中，当遇到环境应激或者动物机体抵抗力降低时，会诱发该病。

禽巴氏杆菌病在临诊上主要分为最急性型、急性型、慢性型^[3]。最急性型常表现为无任何前驱症状，突然倒地，很快死亡，剖检无特殊病变。急性型最为常见，主要表现为败血症，发病率高、死亡率高。慢性型主要表现为鼻窦肿大、肉髯显著肿大、关节炎等，病死率较低，病例剖检的变化常因侵害器官不同而异。Pm的发生给养禽业带来了不同程度的损失，也给禽产品带来了食品安全问题，加强对多杀性巴氏杆菌的研究，对保护养禽业的健康和可持续发展具有重要意义。

1材料与方法

1.1 病料与实验动物

    病料来自于青岛农业大学动物医院的某蛋鸡养殖场送检病死鸡，无菌采集其肺脏、肝脏等器官组织。试验动物昆明小鼠购自青岛派特福德养殖专业合作社。

1.2 主要试剂

犊牛血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，琼脂等培养基购自生工生物工程（上海）股份有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），购自天根生化科技有限公司。DNA Marker、DNA 纯化回收试剂盒均购自宝日医生物技术有限公司，琼脂糖凝胶购自北京陆桥技术有限责任公司。药敏试纸购自杭州天和微生物有限公司，其它试剂和染色液均由山东省预防兽医学重点实验室提供。

1.3 细菌的分离培养与染色镜检

     无菌采集病死鸡病料肺脏、肝脏等组织分泌物，接种于血清琼脂培养基，放入37℃的恒温箱里培养24h，观察菌落生长状态；选取单个菌落进行革兰氏染色并镜检观察其形态特征，并对疑似菌落进行纯化培养。

1.4 PCR鉴定

1.4.1 引物设计与合成 

根据GenBank登录的Pm的 Kmt基因，设计一对引物（见表1），引物由北京百盛生物公司合成，预期产物长度基因为457bp。

表1 引物设计

1.4.2 Kmt 基因的扩增与鉴定

取Pm菌液1ml，离心后取上清液为模板，用Kmt-P₁和Kmt-P₂进行扩增。PCR体系（25μL）：P₁、P₂、DNA模板各1μL，ddH₂O14.75μL，10×Buffer和Mgcl₂各2.5μL，dNTP Mix 2μL，Tap酶0.25μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃ 45 s，55℃45s，72℃ 45s为一个循环，共30个循环，72 ℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定后回收。

1.5 药敏试验

    用纸片-琼脂扩散法将分离菌做药敏试验，把含有分离菌的肉汤培养液涂布于血琼培养基，置于恒温箱孵育1h，取出将药敏纸片贴于培养基表明，37℃过夜，测量抑菌圈直径。

1.6 动物试验

  从纯化培养24 h的血清琼脂平板中挑选6个单菌落，分别无菌接种于含犊牛血清的肉汤培养液中，放入37℃、200 rpm的摇床中震荡24 h。用移液器向新洁净离心管中加入180 uL的灭菌生理盐水并从原离心管中吸取20 uL的菌液，混匀，稀释成1：10的菌液，按上述操作配制成浓度以10倍递减的菌液。吸取100 uL的各稀释菌液移入不同血清琼脂培养基中涂布，置于37℃的恒温箱中培养24 h，菌落长出后计数（CFU/mL）。1 mL菌液活菌数=所选平板菌落数×稀释倍数×10，计算结果与标准值2.5×10⁸ CFU/mL相比较。选择两组活菌数与标准值相近的菌液，分为1组和2组，每组皮下接种6只7日龄的健康小白鼠，1 mL/只，另设3只对照组，接种生理盐水，1mL/只，正常给水给料，饲养24 h观察临床症状及死亡率，并分离细菌进行鉴定。  

2 结果

2.1 分离菌培养特性

用病死鸡肝脏和肺脏组织分别进行细菌分离培养，该分离菌在麦康凯培养基上不生长，在血清琼脂培养基上培养24h后形成圆隆、露滴状、表面光滑的半透明白色菌落，45°折光下可见有淡蓝色荧光，不溶血，革兰氏染色镜检可见菌体钝圆，呈阴性的短杆菌，见图1。该分离菌与多杀性巴氏杆菌的分离培养特性一致。

                     图1  巴氏杆菌纯化培养与染色镜检（10×100）

2.2 Kmt基因的扩增

Kmt基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段小于500bp，与预期相符（图2）。测序后登录NCBI网站进行Blast同源性比对，分离菌与Pm菌株的同源性为99.6%，进一步证实该菌为多杀性巴氏杆菌。

    图2 Kmt基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳  

M：DL2000 DNA分子量标准；1，2：Kmt；3~5：对照                     

2.3 药敏试验  

药敏试验结果表明，分离菌对青霉素、头孢曲松、头孢氨苄、阿莫西林、新霉素、卡那霉素、多西环素、阿奇霉素、等13种抗生素表现出不同程度的耐药，对红霉素、氧氟沙星、庆大霉素中度敏感，对氟苯尼考、阿米卡星高度敏感。根据多重耐药的判定原则，该菌株对两类以上的抗生素同时耐药，判定该菌株为多重耐药菌株。

2.4 动物试验结果  

相同浓度的两种菌液腹部皮下注射小鼠后，1、2组试验小鼠24h内死亡11只，1组6只全部死亡，2组死亡5只，活着的一只眼部出血，对照组小鼠正常。对12只小鼠进行剖检，可见肺脏出血（12/12），肝脏和脾脏出血、肿胀（12/12），肾脏和心脏表明有出血点（11/12）。经鉴定从试验死亡小鼠肺脏中分离到与原分离菌一致的巴氏杆菌，试验表明分离菌与多杀性巴氏杆菌致死小鼠的症状一致，并且该菌具有较强的致病力。                                                             

3  讨论

Pm可以在家禽的上呼吸道和消化道存在，是条件性致病菌，当鸡舍内产生气温骤变、通风不良等应激因素，或者鸡感染其它疫病造成机体抵抗力下降时，容易诱发该菌的繁殖，引起禽霍乱的发生^[4]。该病在临床上发生经常有其它诱发因素，特别是疫病的诱发，常常伴随着败血支原体、大肠杆菌病和沙门氏菌等发生多重混合感染，而忽略了本病，本次从病料中分离的细菌中就含有大肠杆菌。实验室在其它蛋鸡送检病料中，也多次分离到Pm，说明在规模化的蛋鸡养殖场中Pm依然存在，有潜在的发病风险。

Pm容易产生耐药性，本试验中分离的菌株就对青霉素、头孢氨苄、阿莫西林、多西环素、阿奇霉素等13种抗生素表现出不同程度的耐药，这与许多研究报道一致^[5-7]。建议鸡场不要盲目滥用抗生素药物，临床不发病时，不要用抗生素；发病时，尽量用中草药或者益生素代替抗生素；不得不用时要遵守《兽医使用规范》，并且是两种不同的抗生素交叉使用。发生疫病的时候，要先做药敏试验，选择敏感的药物进行治疗，并且要隔离病鸡，加强消毒，把疫情消灭在萌芽状态。

参考文献

[1] 李浩, 刘阳, 李长安. 多杀性巴氏杆菌病研究进展[J]. 畜牧兽医杂志, 2011, 30（2）：31-33.

[2] 唐沙, 袁海文, 杨源, 等. 禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定及基因分型[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44（9）：2724-2730.

[3] 张洁, 曹玲芝, 张楠. 禽霍乱的诊断与防治[J]. 当代畜牧, 2016,（20）：106-107.

[4] 罗璇. 鸭源多杀性巴氏杆菌油乳剂灭活疫苗的制备与应用[D]. 雅安：四川农业大学, 2014.

[5] 刘道泉, 刘小龙, 程龙飞, 等. 10株禽源多杀性巴氏杆菌药物敏感性与质粒多样性分析[J]. 中国家禽, 2017, 39（13）：61-63.

[6] 边彦超, 刘小兰, 康绍珠, 等. 鸡巴氏杆菌的分离鉴定及体外抑制实验[J]. 江西畜牧兽医杂志, 2018, （1）：20-23.

[7] 于成接, 丁优玲, 华亚峰, 等. 禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定及致病性研究[J]. 中国兽医杂志, 2013, 49（2）：21-24.