海兰商品蛋鸡白血病与马立克氏病混合感染的诊断 

马国和，冯杰, 杨恒达，张美玲,王新卫^*

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002）

摘 要：为对河南南阳地区某海兰蛋鸡场鸡群的疑似肿瘤疾病进行确诊，从临床流行病学、剖检症状、病理变化、马立克氏病、禽白血病、网状内皮组织增生症病毒特异基因的PCR检测等进行了综合分析。结果显示：鸡群大体正常，但零星出现死亡，死亡鸡极度消瘦，心、肝、脾、肺等脏器肿胀及个别病鸡脏器肿胀且有肿瘤结节，PCR检测结果显示：MDV阳性 、ALV 阳性、REV阴性。以上结果证实鸡群感染马立克氏病病毒和禽白血病病毒。

关键词：马立克氏病; 禽白血病; 诊断； PCR

马立克氏病(Marek’s disease,MD)是最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病，以外周神经和包括虹膜、皮肤在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征。该病传染性强，常给家禽生产带来严重损失。禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类的多种肿瘤性疾病的统称，在自然条件下以淋巴白血病最为常见，世界各地均有本病存在，大多数鸡群均有感染，但出现临诊症状的病鸡数量较少^[1]。ALV有两种传播方式：水平传播和垂直传播。大多数鸡通过与先天感染鸡的密切接触获得感染，从而给后来的生产带来不可估量的损失^[2,3]。网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis Virus,REV）属哺乳动物C型反转录病毒属，只有一个血清型，除引发肿瘤外，常在感染鸡群中引起严重的免疫抑制或免疫耐受^[4]。这三种病毒生产中可以单独感染也可以二重或三重混合感染，引起鸡群严重的免疫抑制，继之诱发细菌性及其它病毒性感染^[5]，给鸡群造成更大的损失。在近几年,地方蛋鸡和肉鸡均有MDV和ALV的混合感染的报道，但在海兰蛋鸡中MDV和ALV的混合感染却少见报道。

2017年5月，南阳某养殖场鸡群从80日龄发病，并出现死亡，至113日龄时，鸡群仍不断死亡。养殖场主随即来河南农业大学禽病所就诊，现将诊断结果报告如下：

1 材料

1.1病例

河南南阳某鸡场海兰蛋鸡10000羽，发病鸡群就诊日龄为113日龄。主诉鸡群从80日龄发病并零星死亡，零星死亡现象一直持续到100日龄（每天1～2只死亡），100～113日龄死亡增加，每天死亡5～8只鸡。但鸡群大体精神尚可，典型的变化是，不断有弱鸡出现，这些鸡精神不振，沉郁少动、采食量低、极度消瘦或新发病鸡趋于消瘦。鸡冠苍白、皱缩，有的病鸡可触摸到肿大的肝。

1.2主要试剂

DNA Marker DL 2000、Taq DNA聚合酶、RRI、M-MLV反转录酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取用Trizol LS Reagent购自Invitrogen公司；琼脂糖购自BIOWEST AGAROSE公司

1.3主要仪器

生物安全柜、酶标仪购于Thermo Fisher Scientific公司；PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司；ECP3000三恒多用电泳仪购买于北京六一仪器厂；紫外凝胶成像系统购买于美国Alpha Innotech公司；Univeral 32 R高速冷冻离心机购于德国Hettich公司；HH-4数显恒温水浴锅购自于国华电器有限公司

2方法

2.1临床症状观察

   询问养殖户以及现场观察病鸡，记录发病症状。

2.2剖检病变观察

   按照病理学常规方法剖检病死鸡，并记录其典型的病理变化。

2.3病毒分离鉴定

2.3.1  MDV的分离及引物设计 将来自河南南阳某鸡场的肿瘤病送检病料（脾和肿瘤组织），用研磨器无菌研磨(8000r/min,5min)，按病料1：5加入PBS液，病料反复冻融3次备用。然后采用酚-氯仿抽提法提取患病组织DNA。同时设计一对特异性引物如下：MDV UL19 P5上游：5′—CCC GAT ATT ATC ATT KCH CC—3′和MDV UL19 P6下游：5′—CTC GCA TTA TTA TCT GAA GT—3′，扩增的DNA片段预期长度为521 bp。

2.3.2  ALV和REV的分离及引物设计 因其出现贫血及肿瘤现象，将组织病料用TRIZOL试剂快速提取法提取RNA，经反转录成cDNA。设计合成一对针对ALV特异性引物如下：ALVgp85 U2上游：5′—GCC ACC TCC CCT TTT CAA—3′和ALVgp85 L2下游：5′—GAA AAT TSC GGG TGG TAG C—3′，扩增的DNA片段预期长度为778 bp。同时设计一对REV特异性引物如下：REV-1上游：5′—CAT ACT GGA GCC AAT GGT T—3′和REV-2下游：5′—AAT GTT GTA CCG AAG TAC T—3′，扩增的DNA片段预期长度为291bp。

3 结果与分析

3.1病例的临床症状

病鸡主要症状为鸡冠发白，脚爪干瘦无光泽（见图1），精神沉郁、消瘦。同时可见部分病鸡虹膜受到侵害导致失明，一侧或者两侧虹膜不正常，色彩消退。

3.2剖检的病理变化

剖检病鸡主要见内脏肿瘤：肝脏肿大，见有多个肿瘤结节，结节呈纽扣状或者其他形状，大小不一，遍布肝脏（见图2）；脾脏肿大，可见肿瘤增生（见图3），肾脏局部肿大，肿瘤结节可见（图4），个别肺部亦出现肿大或者肿瘤增生。

图1：脚爪干瘦                        图2：肝脏肿大有明显结节

          图3：脾脏重度肿大                     图4: 肾脏肿大

3.3病毒分离鉴定结果

3.3.1 MDV的PCR鉴定 以提取的DNA为模板进行PCR扩增，产物的凝胶电泳结果显示在约521bp左右出现清晰的目的条带（图5），与预期的产物片段大小一致，即MDV阳性。凝胶电泳结果如下图所示。

图5  MDV  PCR 扩增结果

M、DNA marker（DL 2000）； 1、病料； 2、阳性对照； 3、阴性对照

3.3.2 ALV和REV的PCR鉴定                          

利用组织血液RNA提取试剂盒提取患病组织RNA，经反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，产物的凝胶电泳结果显示在约778bp左右出现清晰的目的条带（图6），与预期的产物片段大小一致，即ALV阳性,但在291bp处未呈现相应条带(图7），即REV阴性。凝胶电泳结果如下图所示。

图6  ALV  PCR 扩增结果

M、DNA marker（DL 2000）；1、病料； 2、阳性对照）；  3、阴性对照

图7  REV  PCR 扩增结果

M、DNA marker（DL 2000）；1、病料 ；2、阳性对照；3、阴性对照

根据该鸡场鸡群的发病情况，临床症状、病理剖检变化、PCR及RT-PCR结果显示MDV阳性 、ALV 阳性、REV阴性等综合分析，可确诊该发病鸡群为马立克氏病病毒和禽白血病病毒混合感染。综合以上检查结果，确诊该鸡场鸡群混合感染了马立克氏病病毒和白血病病毒。

4讨论

根据该鸡场鸡群的临床表现：鸡群精神沉郁、消瘦、鸡冠发白、脚爪干瘦，发病日龄从80日龄至送诊时不断有病鸡出现，而且，病理剖检变化：肝脏、肾脏等脏器肿瘤结节，结合实验室的PCR检测结果证实该商品海兰蛋鸡群感染了马立克氏病病毒和禽白血病病毒。

马立克氏病、禽白血病和网状内皮组织增生症病均为禽病中常见的病毒性肿瘤病^{[ 6]}。它们均可引起免疫抑制，也可共感染或引起继发、混合感染导致鸡群生产性能下降等^{[ 7]}。这些疾病在我国没净化鸡群存在更为常见^{[ 8]}。但近年来，其中的两种疾病共感染在海兰净化鸡群发生还是不多见^{[ 9]}。而对于该海兰鸡群发生MD和AL共感染的原因值得思考。

本病例中，MD发生的可能原因有：如环境存在强毒导致疫苗毒不能保护鸡群，或者漏防，或者母源抗体干扰，此外也不能排除种鸡群携带白血病病毒，引起子代鸡先天性感染干扰MD疫苗的免疫而引起MD发生。而对白血病，我国海兰蛋鸡，尤其引进的祖代鸡，都进行了白血病净化。商品代海兰蛋鸡白血病的发生和流行率很低，发病病例也很罕见。而本病例的海兰商品代蛋鸡感染白血病的原因值得探究。养鸡场主反映，发病鸡为引进青年鸡，对鸡苗的来源与免疫情况不了解，卖方仅仅说该防疫疫苗均做了防疫，该批青年鸡的父母代种禽来自质量可靠的大厂家。但该病传播方式为垂直传播和水平传播。鸡群感染并发生白血病的最可能原因种鸡带毒、孵化室污染或者后来使用了劣质疫苗（存在白血病病毒污染的疫苗等^{[ 10]}，但到底是哪个具体风险因子导致，因涉及到多个厂家，使用的疫苗也不明晰无从查起。

为进行鉴别诊断，笔者进行了REV的检测，发现为阴性，而MDV和ALV阳性。进一步排除了REV。支持了MD与AL共感染。这说明，在实际家禽生产中，还存在很多生物安全隐患，导致这些肿瘤性疾病发生；也暗示我国种禽场需要进一步加强这些疾病的净化，同时也应加强对生产活疫苗厂家的监管，以防通过劣质疫苗引入这些疾病给鸡群；更需要注意的是商品代养殖户要提高自身的生物安全措施和管理水平。以便共同防控疫病，为家禽生产提供保障。

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[5] 崔治中.免疫抑制性病毒多重感染在鸡群疫病发生和流行中的作用[ J] .中国家禽, 2003 , 25(20):1-4.

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