中国实验方剂学稿件信息
腰果叶多酚超声波辅助提取工艺及其抗氧化能力测定
王彦阳，张中润，黄海杰，钟天映，高燕
文章已被食品研究与开发杂志社录用，食品研究与开发杂志投稿网站链接：http://www.zazhi114.cn/shipinyanjiuyukaifa
(1.江门职业技术学院，广东 江门 529090；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南儋州 571737；3. 广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东广州 510640)
摘要: 以腰果叶为原料，在单因素试验结果上，利用响应面法优化腰果叶多酚超声波辅助提取工艺，考察其还原力以及对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。在单因素试验基础上建立腰果叶多酚提取的二次多项数学模型。1.0g腰果叶粉末，所得到最优提取工艺条件为：丙酮体积分数60%、提取温度60℃、提取时间90min，实测得率为10.29%，与预测值10.30%基本相符。腰果叶多酚提取物对DPPH、ABTS自由基的清除作用呈现量效关系，半数抑制浓度(IC50) 值分别为3.88、36.44mg/L，相同浓度下腰果叶多酚提取物抗氧化性高于天然抗氧化剂VC。
关键词：腰果叶；多酚；超声波提取；抗氧化能力
Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenol from Cashew Leaf
WANG Yan-yang ZHANG zhong-run Huang Hai-jie ZHONG Tian-ying GAO Yan
(1. Jiangmen Polytechnic, Jiangmen, Guangdong 529090, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture, Danzhou, Hainan 571737, China; 3. Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou, Guangdong 510640, China)
Abstract: In order to determine the optimum technology and conditions to extract polyphenol from cashew leaf，the Cashew Leaf polyphenols mathematical model was established by using the response surface method based on the results of single factor experiments. Meanwhile, the antioxidant activity of the extracted polyphenol was evaluated. The best technical conditions to extract polyphenol from cashew leaf were obtained as follows: the concentration of acetone solution 60%, extraction temperature 60℃ and ultrasonic time 90min，when the cashew leaf were 1.0g.The predicted polyphenol extraction yield was 10.29%. Under the optimized condition, the experimental yield was 10.30%. The effect of cashew polyphenol extract on DPPH, ABTS free radical scavenging effect, half of the inhibitory concentration (IC50) values were 3.88 and 36.44mg/L respectively. The antioxidant activity of cashew polyphenol extract at the same concentration was higher than that of natural antioxidant VC.
Key words: Cashew leaf; Polyphenols; Ultrasonic extraction; Antioxidant ability
腰果(Anacardium occidentale L.)原产巴西东北部地区，在我国已有80多年的引种栽培历史，我国海南西南和东南部，云南西双版纳都有引种栽培，是我国热带地区经济价值高、用途十分广泛的珍贵植物[1]。腰果具有非常高的营养药用和保健价值[2]，长期食用腰果果托或果汁可以控制肿瘤的生长，腰果中含有的脂肪有很好的软化血管作用，对保护血管、防治心血管疾病大有益处[3]，有研究显示浓缩腰果蛋白可作为营养添加剂添加入食品中[4]。目前有关腰果的研究集中在腰果蛋白的提取及其特性[5-9]、腰果脂肪提取工艺及腰果加工的报道[10-13]，对腰果多酚研究较少。植物多酚是植物次生代谢产物，具有独特的药物活性和生理功能，大量研究表明植物多酚在抗诱变，抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗衰老和预防中风等多方面具有显著功效，因而在医药、生化及日用化工等领域具有广阔的开发前景[14-15]。本研究采用超声波辅助提取海南产腰果叶多酚，利用响应面法优化腰果叶多酚的提取工艺条件，并对其进行了体外抗氧化活性评价，为进一步研究腰果叶活性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
将腰果叶洗净后烘干，粉碎过0.25mm筛后置于干燥器中备用。没食子酸；福林酚试剂；DPPH(1，1－二苯基－2－三硝基苯肼)、ABTS(2，2'－联氮－双－(3－乙基苯并噻唑－6－磺酸))；氯化铁、铁氰化钾、抗坏血酸、BHT、三氯乙酸、无水乙醇等均为国产分析纯。XO-5200DTS超声波清洗仪；LGJ-10冷冻干燥机；WK－1600A 小型高速粉碎机；EL204电子天平；KQ5200DE数控超声波清洗器；H1650高速台式离心机；Ｒ－201D旋转蒸发器。
1.2 方法
1.2.1多酚标准曲线的制作
参照Folin-Ciocalteu法[16]，以没食子酸为标准品进行标准曲线绘制。用少量蒸馏水溶解并定容0.1g没食子酸至100mL得对照品溶液。取对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0mL分别置于50mL容量瓶中并定容。取上述溶液各0.25mL到7个10mL容量瓶中，分别加入3.75mL蒸馏水和0.25mL福林酚试剂，摇匀后静置反应10min，加入0.75mL7.5%无水碳酸钠溶液，30℃下静置1.5h后定容，测定其在725nm处的吸光度，所得回归方程为Y=0.49.2986X+0.0528(Ｒ2=0.9992)。
1.2.2腰果叶多酚含量提取及测定
一定体积分数溶剂下，按一定温度及超声波处理时间萃取腰果叶粉末1.0g后得到粗提液。将粗提液离心5min后(5000r/min)取上清液，经旋转蒸发器去除乙醇后用蒸馏水定容至100mL得腰果叶多酚提取液，4℃避光保存。取25mL腰果叶多酚提取液定容至50mL，按照1.2节方法测定多酚质量浓度，多酚提取率=(提取出的多酚质量/腰果叶质量)×100%
1.2.3 Box－Behnken试验设计
选取丙酮体积分数（X1）、提取温度（X2）、超声波处理（100W）时间(X3)三个因素，分别考察其单独作用时对腰果叶多酚提取率的影响。在单因素实验的基础上，每个因素选取三个对多酚提取率影响较大的水平，利用Design－Expert8.0软件建立3因素3水平响应面分析法，通过回归统计模型确定腰果叶多酚超声波提取的最佳工艺参数。
1.2.4 腰果叶多酚抗氧化活性[17-18]
DPPH自由基清除率的测定:用蒸馏水稀释腰果总酚提取液500μL至不同浓度，取稀释后不同浓度的腰果总酚提取液5.0mL与5.0mLDPPH(1mmol/L)溶液混合，避光静置30min后于517nm处测定吸光值(n1)。同时测定5.0mL蒸馏水与5.0mLDPPH溶液、5.0mL相应浓度提取液与5.0mL无水乙醇的517nm光吸收值(用n2、n3表示)。DPPH清除率（%）=[1－(n1－n3)/n2]×100。
ABTS自由基清除率的测定：5.0 mL7mmol/L的ABTS溶液与88.0μL140mmol/L的K2S2O8混合后于避光反应12h~16h得到ABTS备用液。用70%乙醇稀释备用液，直到734nm处的光吸收值为0.7±0.02得ABTS工作液。分别取0.1mL不同浓度腰果总酚提取液与3.9mLABTS工作液混合室温避光反应，6min后测定在734nm处测定吸光值(A样品);以0.1mL蒸馏水与3.9 mLABTS工作液混合6min后进行空白试验(A空白)。ABTS自由基清除率（%）=(A空白－A样品)/A空白×100。
铁还原力测定: 腰果总酚提取液200μL、1mL的磷酸缓冲液(pH值6.6)、1mL10g/L铁氰化钾溶液混匀后于50℃恒温水浴20min。冷却后加入1mL10%的三氯乙酸溶液离心15min（2000r/min）。取上层清液2mL，加入2.0mL蒸馏水、1mL三氯化铁溶液(1g/L)振荡混匀后700nm处测定光吸收值。以上所有测定均以同浓度的Vc 为对照。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.2 丙酮体积分数的影响: 固定提取时间为20min，提取温度为30℃，研究丙酮体积分数为25%、35%、45%、55%、65%、75%对腰果叶提取率的影响，结果如见1(a)，在25%～75%范围内，丙酮体积分数为55%时酚类物质提取率达到最大值，随后有所下降，原因可能是丙酮体积分数过高，脂溶性物质溶出增大，从而影响了神秘果叶多酚的提取率；最终选定45%、55%、65%用于响应面分析。
2.1.2温度的影响
固定提取时间为20min，丙酮体积分数为50%，在30、40、50、60、70、80℃下研究不同温度对腰果叶提取率的影响，结果见图1(b)，60℃以下提取率率呈上升趋势，而60℃之后得率有所下降，原因可能是高温破坏了多酚的化学结构。最终选定温度50、60、70℃用于响应面分析。
2.1.3 超声波处理时间的影响
固定提取温度为30℃，丙酮体积分数为50%，研究不同提取时间20、30、40、50、60、70min对腰果多酚提取率的影响，结果如图1(c)所示，在超声波辅助下短时间内就能对腰果叶多酚进行充分的提取，超声波处理90min时，多酚得率8.92%。当超声提取时间大于90min后多酚提取率率有下降趋势，原因可能是因为超声波长时间作用使得多酚分子结构被破坏。最终确定以时间70、90和100min用于响应面分析。
图1 不同提取条件对多酚得率的影响
Fig.1 Effect of different factors on yield of polyphenol
2.2 腰果叶多酚提取工艺响应面优化
2.2.1模型的建立与显著性分析
根据Box-Benhnken 模型，以丙酮体积分数、提取温度、超声波处理时间为自变量(分别用X1 ，X2 和X3 表示)，腰果叶多酚的提取率为响应值(用Y表示)。响应面试验因素与水平设计见表1。
表1 试验因素与水平设计
Table 1 levels of factors in response surface methodology
|
水平 |
丙酮体积分数/% |
提取温度/℃ |
超声时间/min |
|
-1 |
45 |
50 |
70 |
|
0 |
55 |
60 |
90 |
|
1 |
65 |
70 |
110 |
根据试验因素与水平设计，试验结果见表2，用Design Expert 8.0软件试验数据进行回归分析，得二次多项回归模型方程:Y=－37.51575+0.4616X1+0.3642X2+0.5312X3－0.00065X1X2+0.0002X1X3 +0.000175X2X3 －0.00381X12－0.00291X23－0.00309X32，该模型方程方差分析结果见表3。回归模型P＜0.0001，失拟项P=0.2905＞0.05，模型具有高度的显著性，能很好地拟合本试验结果，可用于腰果叶多酚提取率的理论预测。模型系数R2 =0.9860，回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，模型的调整确定系数R2Adj =0.9679，变异率仅有1.39%，因此，可采用此二次回归模型确定腰果种子多酚的最佳提取工艺。
表2 响应面实验设计和结果分析
Table 2 Design matrix and results of response surface experiment
|
编号No． |
X1丙酮体积分数 |
X2提取温度/℃ |
X3超声波时间/min |
多酚提取率/% |
|
|
试验值 |
预测值 |
||||
|
1 |
65 |
50 |
90 |
10.02 |
9.95 |
|
2 |
55 |
60 |
90 |
10.16 |
10.29 |
|
3 |
55 |
60 |
90 |
10.33 |
10.29 |
|
4 |
55 |
50 |
110 |
8.58 |
8.71 |
|
5 |
55 |
60 |
90 |
10.31 |
10.29 |
|
6 |
65 |
70 |
90 |
9.66 |
9.72 |
|
7 |
65 |
60 |
110 |
8.92 |
8.92 |
|
8 |
45 |
50 |
90 |
9.45 |
9.39 |
|
9 |
55 |
60 |
90 |
10.45 |
10.29 |
|
10 |
55 |
60 |
90 |
10.21 |
10.29 |
|
11 |
55 |
50 |
70 |
8.92 |
8.86 |
|
12 |
55 |
70 |
70 |
8.88 |
8.75 |
|
13 |
65 |
60 |
70 |
8.85 |
8.92 |
|
14 |
45 |
70 |
90 |
9.35 |
9.42 |
|
15 |
45 |
60 |
110 |
8.42 |
8.35 |
|
16 |
45 |
60 |
70 |
8.51 |
8.57 |
|
17 |
55 |
70 |
110 |
8.68 |
8.68 |
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
|
方差来源source |
平方和 Sum of squares |
自由度 df |
均方 MS |
F值 F value |
P值 （prob＞ F） |
显著性 significant |
|
Model |
8.343931765 |
9 |
0.93 |
54.68 |
< 0.0001 |
** |
|
X1-丙酮体积分数/% |
0.3698 |
1 |
0.37 |
21.81 |
0.0023 |
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