构建调节固醇调节元件结合蛋白1c表达的长链非编码RNA lncHR1转基因小鼠

李端，郭利伟，杨婷婷，张瑞岭

（1新乡医学院基础医学院微生物学教研室453003；2新乡医学院第二附属医院，453002；3新乡医学院法医学院，453003；4新乡医学院基础医学院453003；河南省新乡市）

文章已被生物技术杂志社录用，生物技术杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/shengwujishu

摘要 目的:构建调节固醇调节元件结合蛋白1c表达的长链非编码RNA lncHR1转基因小鼠。方法: lncHR1表达质粒的线性化和线性化DNA调节固醇调节元件结合蛋白1c的表达；线性化DNA注射受精卵原核细胞、胚胎移植代孕C57BL/6J；F0代lncHR1表达阳性的雄性小鼠的筛选；稳定表达lncHR1的F1代转基因小鼠扩繁；F1代转基因小鼠肝脏组织中lncHR1的表达及其调节固醇调节元件结合蛋白1c的表达。结果：线性化lncHR1质粒DNA成功重组到C57BL/6小鼠基因组，获得稳定表达lncHR1的F1代转基因小鼠（lncHR^TG），初步验证lncHR1在肝脏组织中调节固醇调节元件结合蛋白1c表达。结论：获得抑制固醇调节元件结合蛋白1c表达的lncHR1转基因小鼠。

关键词：固醇调节元件结合蛋白1c；长链非编码RNA；转基因小鼠

通讯作者：李端（1979年6月生），博士，讲师，主要从事非编码RNA在代谢异常疾病发生过程中作用的研究工作。

基金支持：河南省科技攻关计划（Programs for Science and Technology Development of Henan，172102310499）；河南省生物精神病学重点实验室开放课题（Open Program of Henan Key Laboratory of Biological Psychiatry，ZDSYS2016007）；新乡医学院博士科研启动基金（XYBSKYZZ201605）。

长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）一般定义为由RNA 聚合酶Ⅱ转录、长度多于 200 个核苷酸、缺少有效开放阅读框（ORF）、无或很少有编码蛋白能力的一类非编码RNA，lncRNA构成机体内错综复杂的调控网络的重要组成部分(Huttenhofer et al. 2005; Ponting et al. 2009; Wilusz et al. 2009)。研究表明(Taft et al. 2010)： lncRNA通过表观遗传、基因剪辑调节、lncRNA-microRNA相互作用、lncRNA-蛋白相互作用等形式，参与肿瘤基因的抑制或激活。HCV的慢性感染是导致肝脏疾病甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）的重要原因之一，研究发现(Zhang et al. 2015)：lncRNA  LINC01419在HCV相关的HCC发生早期表达显著上升；在HCC 晚期阶段，lncRNA AF070632表达降低、lncRNA AK021443表达显著升高；其中LINC01419和AK021443能够参与肝细胞周期， AF070632参与肝脏内氧化还原和羧酸分解过程。FAL1是HCC组织内表达上调的lncRNA，研究显示：FAL1作为一个癌基因能够竞争性的结合miR-1236、促进肝细胞的增殖和迁移；病人血清和外泌小体中高表达，能够使FAL1转移到肝癌细胞处，并提高癌细胞的增殖和转移风险(Li et al. 2018)。对临床35例丙型肝炎患者、22例HCV感染引起的肝纤维化患者和10例HCV相关的HCC患者研究提示lncRNA-HEIH可以作为临床HCV相关的HCC的潜在生物标志物(Zhang et al. 2017)。固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol-regulatory Element-binding Protein 1 c，SREBP-1c）激活一系列参与脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成的酶，在维持肝脏脂类代谢稳定方面有重要作用。研究结果显示(Shimomura et al. 1999b)：SREBP-1c在肝细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和转基因小鼠的肝脏中调节FAS表达、影响TG累积，SREBP-1c表达异常与脂肪变性、肝纤维化，肝硬化以及HCC的发生存在密切关系。前期研究结果发现(Li et al. 2017)：丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）激活长链非编码RNA lncHR1 (HCV regulated lncRNA 1, lncHR1)表达；lncHR1调节SREBP-1c表达，并且影响细胞内甘油三酯的累积。

丙型肝炎病毒相关的lncRNA通过调节SREBP-1c分子表达参与脂类代谢的动物模型研究没有报道。本研究构建了稳定表达lncHR1转基因鼠，并对lncHR1调节肝脏组织内SREBP-1c的表达进行研究，为非编码RNA作为临床治疗脂类代谢紊乱提供新的动物模型。

1.材料与方法

1.1质粒、细胞株和实验动物  lncHR1表达质粒pMIR-lncHR1由本课题组克隆保存，肝癌细胞株Huh7.5.1和293T细胞由课题组保存，C57BL/6J购自北京维通利华生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和试剂盒  核酸酶ClaI（Catalog #R0197L）购自NEB，质粒大量提取试剂盒/胶回收试剂盒、一步法克隆试剂盒（Giantagen），QuantiFast SYBR Green荧光实时定量PCR试剂盒（QIAGEN），组织RNA提取试剂盒购自北京索莱宝公司，SREBP-1c单克隆抗体（SCRUZ），Actin鼠单克隆抗体（Sigma）；转染试剂LipoD293™ DNA In Vitro Transfection Reagent（SignaGen Catalog #SL100668）。

1.3方法

1.3.1线性化pMIR-lncHR1质粒

根据Li Duan等(Li et al. 2017)的报道，lncHR1的基因序列和表达质粒等分子生物学特征，在表达质粒pMIR-lncHR1启动子区域上游487bp处选取单酶切位点ClaI，根据NEB提供使用说明进行单酶切；线性化质粒DNA采用核酸琼脂糖凝胶电泳回收线性化片段，纯化线性化质粒DNA用于细胞实验。

1.3.2线性化质粒DNA的功能性实验

（1）瞬时转染细胞  细胞瞬时转染线性化质粒DNA  Huh7.5.1在DMEM培养基中培养（含10% FBS、1% NEAA、1% penicillin和1% streptomycin）细胞培养条件为37°C，5% CO₂。转染前24小时，用含10% FBS的培养基在24孔板内接种培养细胞，37℃，恒温、5%CO₂培养箱培养，待细胞长到80％汇合度，转染前1小时更换新鲜的完全培基。用空DMEM培养基稀释1μg DNA质粒、轻柔混匀；空DMEM培养基稀释2μl转染试剂D293、轻柔混匀。将转染试剂逐滴加入到稀释的质粒中，轻柔混匀，室温静置温育15分钟。将混匀的质粒和转染试剂混悬液均匀滴加入待转染的细胞中、轻轻晃动，以使其分布均匀。5～8小时换成新的含10% FBS的培养基；继续培养48小时后即可收取细胞，进行后续实验。

（2）qRT-PCR检测lncHR1和SREBP-1c表达检测  利用Trizol法提取细胞总RNA（具体操作按照试剂盒说明书进行）。根据QIAGEN公司QuantiFast SYBR Green荧光实时定量PCR试剂盒的使用说明，以总RNA为模版，对lncHR1、SREBP-1c、β-actin的mRNA水平进行相对定量测定。反应体系包括（20μl）：上下游引物（10μM）各0.6μl，RNA模板1μl，酶混合物（RNA反转录酶和DNA聚合酶）0.2μl，2×Quanti-Fast SYBR Green RT-PCR Master Mix 10μl，RNase-free水7.6μl。反应条件为50℃，10分钟；95℃，5分钟；40次循环反应，循环条件为95℃，10秒，60℃，30秒；溶解曲线65～95℃，连续；相对定量中以管家基因β-actin为内参，用2^-△△Ct法分析mRNA转录水平的变化。

表1：细胞水平的实时荧光定量PCR检测引物

（3）Western blot实验检测SREBP-1c表达  按照文献(Si et al. 2012)方法进行蛋白质电泳：①收集的细胞沉淀中加入1×SDS上样缓冲液，混匀、煮沸5～10分钟，立即置于冰上，静置10分钟；②制备SDS-PAGE浓缩胶及分离胶；③80V 电压进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，将凝胶上的蛋白恒流转移至PVDF膜上；转移完毕后，将PVDF膜置于5% BSA封闭液中，37℃封闭2小时；加入anti-SREBP-1c或β-actin一抗（5%脱脂奶粉或者5% BSA稀释）孵育，37℃孵育1小时或者4℃过夜；用TBST洗3次膜，每次10分钟；加入辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（5% BSA稀释）孵育，37℃，1小时；用TBST洗3次膜，每次6分钟；加入ECL发光液，X-胶片曝光，并进行显影、定影。

1.3.3 lncHR1转基因小鼠的构建

（1）Founder 0（F0）代lncHR1转基因小鼠的构建  ①线性化质粒pMIR-lncHR1DNA采用酚氯仿沉淀方法回收，纯化后的线性化质粒浓度不能低于100ng/μl，体积不能少于30μl；②F0代表达lncHR1转基因小鼠由中国医学科学院实验动物研究所张连峰教授课题组帮助构建，操作过程为：4周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠为供体，诱导小鼠获得受精卵原核，以线性化pMIR-lncHR1 DNA为载具，显微注射受精卵200-300枚，移植胚胎到代孕C57BL/6J小鼠体内，出生小鼠剪尾，提取基因组DNA，以小鼠基因组插入lncHR1的为F0代转基因小鼠。检测方法如下：设计跨质粒启动子引物，采用PCR方法检测子代小鼠基因组中是否整合线性化质粒pMIR-lncHR1的DNA，产物长度1145bp；特异性引物序列见表1，反应条件按照一步法RT-PCR试剂盒PrimeScript One Step RT-PCR kit Ver.2 (TAKARA) 进行。

表2： lncHR1转基因小鼠的检测引物

（2）F1代稳定表达lncHR1转基因小鼠扩繁  ①以lncHR1插入小鼠基因组水平较高的F0阳性雄性小鼠和野生型C57雌性小鼠进行扩繁（1:4合笼）；②获得的小鼠进行鼠尾RNA提取，检测表达lncHR1小鼠为F1代转基因小鼠（lncHR1^TG），产物长度长度为420bp；处死小鼠、将肝组织分成小块分装、迅速冻于液氮中，进行后续实验。

1.3.4 F1代lncHR1转基因小鼠肝脏组织中lncHR1和SREBP-1c检测

采用组织RNA提取试剂盒（北京索莱宝）进行肝组织总RNA提取，进行肝组织中lncHR1和SREBP-1c表达的检测，mRNA检测方法同1.3.2（2）；肝组织蛋白提取方法如下（普利莱生物技术公司）具体操作如下：肝组织精确称重，加入裂解液20μl/1mg组织，用电动高速匀浆器破碎组织，室温静置10分钟；取适量上清液，转移到1.5ml离心管中，70℃加热10分钟，用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量，蛋白的western blot实验方法同检测方法同1.3.2（3）。

2.结果

2.1 lncHR1质粒线性化及其功能性实验

采用NEB的核酸内切酶，将lncHR1质粒线性化，核酸琼脂糖凝胶（Marker15000，M15）结果显示（图1 A）：对照质粒lncHR1和ClaI酶线性化的DNA片段在5000bp左右，符合完全酶切、形成线性DNA的要求。通过常规操作转染，收集细胞进行实时荧光定量PCR反应，结果显示：线性化lncHR1（linearized lncHR1）与对照质粒（Control）相比，线性化质粒DNA表达lncHR1达到100倍以上（图1 B）。

图1. 质粒lncHR1线性化DNA核酸电泳和细胞内表达实时荧光定量PCR

通过常规操作转染，收集细胞进行Western blot 实验，线性化lncHR1在细胞水平上能够显著下调SREBP-1c在mRNA（图2 A）和蛋白水平的表达（图2 B）。

图2. 线性化lncHR1质粒DNA调节 SREBP-1c表达

2.2 lncHR1转基因小鼠的构建

传统转基因技术构建表达lncHR1转基因小鼠，共获得71只小鼠，通过剪取小鼠鼠尾、提取总基因组DNA，常规PCR反应引物见表1，阳性对照为质粒lncHR1，阴性对照为H₂O和空白（NC），通过核酸琼脂糖凝胶电泳（Marker2000，M2），结果显示（图3）：13只小鼠基因组中插入片段长度为1145bp左右的lncHR1 DNA。

图3. F0转基因小鼠筛选电泳图

2.3 F1代lncHR1转基因小鼠肝组织中lncHR1和SREBP-1c检测

对获得代转基因小鼠肝组织中的lncHR1进行转录水平进行检测（n=6），结果如图4 A所示：lncHR1表达组小鼠（lncHR1^TG）与同窝野生型小鼠（Control）相比，lncHR1^TG的相对表达增高10倍左右；同时，肝组织中SREBP-1c的mRNA表达受到抑制（n=6）（图4B），与Control相比，lncHR1转基因小鼠肝组织中SREBP-1c的蛋白表达也受到抑制（n=2）（图4C）。

图4. F1转基因小鼠中lncHR1表达和SREBP-1c的表达

3.讨论

SREBP激活一系列参与内源性胆固醇、脂肪酸、TG和磷脂合成的酶，参与调节了胆固醇和脂肪酸的生物合成，在调节脂质合成和胆固醇代谢上有重要作用(Brown and Goldstein 1997)。其中SREBP-1c属于转录因子的螺旋圈-螺旋-亮氨酸拉链家族(Brown and Goldstein 1997)，调节与脂质生成相关的基因(Shimomura et al. 1999a)，表达于肝脏。SREBP-1c是胰岛素和葡萄糖调节脂肪合成信号途径中的一个介导分子，可能涉及胰岛素抵抗、脂肪肝等(Eberle et al. 2004; Foufelle and Ferre 2002; Shimano 2002)。研究表明，SREBP-1c作为一种转录调节因子参与调节胰岛素信号途径中的靶基因(Flier and Hollenberg 1999)。在动物组织或细胞内使SREBP-1c高表达，可以引起TG堆积，同时伴有参与脂质合成的基因的高表达(Shimano et al. 1999; Yamashita et al. 2004)，与之相反，在肥胖小鼠模型中，如果同时敲除SREBP-1c，脂肪肝可以得到明显改善，脂质合成相关酶的表达也相应减少(Yahagi et al. 2002)。SREBP-1c表达在非酒精性脂肪肝病中显著增高，与对照组相比升高约高五倍(Kohjima et al. 2008)。 Hortn等(Horton et al. 2002)发现：SREBP-1c在核内能转录活化与脂肪生成相关的基因，同样，在转基因小鼠肝脏中过表达这些蛋白会导致脂肪生成增加，从而导致脂肪肝(Shimano 2001)。转基因小鼠肝脂肪变性，与感染HCV的病人相似，血浆TG水平较低(Lerat et al. 2009)。同时发现，在ob/ob鼠肝脏中，SREBP-1c基因失活会导致TG的累积减少约50%(Sekiya et al. 2003)，这显示SREBP-1c在胰岛素抵抗动物的肝脂肪变性过程中发挥重要作用。

研究表明，在肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等肝病中，某些lncRNAs出现差异表达并参与疾病病理过程的调控。越来越多的证据 表明，lncRNA在多个层面参与基因的表达调控，lncRNA表达异常更多的参与了包括肿瘤在内的人类疾病病理过程的发生(Chen et al. 2013; Gutschner and Diederichs 2012)，调节异常的BCAR4， PCA3和HULC，各自与乳腺癌，前列腺癌和肝细胞癌相关(Filella et al. 2013; Godinho et al. 2011; Xie et al. 2013) 。HULC（Highly up-regulated in liver cancer）是HBV相关的肝癌组织中高表达的lncRNA，(Panzitt et al. 2007)，可以通过调节HBV蛋白的表达参与肝病的发生过程。已有研究表明(Yan et al. 2016)，长链非编码RNA MALTA1能够调节SREBP-1c的核内转运，从而参与肝纤维化和产生胰岛素抵抗。

前期研究结果显示(Li et al. 2017)，HCV感染宿主肝细胞造成lncRNA的差异表达，并初步筛选出HCV调节的、表达上调的lncRNA（HCV regulated 1）lncHR1是首次报道的、能够调节SREBP-1c的非编码RNA，并且只在人的基因组中存在，在大鼠、小鼠等的常见模式动物基因组中无同源序列，因此我们采用C57BL/L6J小鼠，构建过表达lncHR1的转基因鼠，获得在小鼠肝组织内高表达lncHR1的转基因小鼠，进而对其调节SREBP-1c的表达进行检测。该转基因小鼠为非编码RNA参与肝组织脂类代谢研究提供合适的动物模型，为治疗临床脂类代谢紊乱提供可靠的数据支撑。

参考文献

Brown MS, Goldstein JL (1997) The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor Cell 89:331-340

Chen G et al. (2013) LncRNADisease: a database for long-non-coding RNA-associated diseases Nucleic Acids Res 41:D983-986 doi:10.1093/nar/gks1099

Eberle D, Hegarty B, Bossard P, Ferre P, Foufelle F (2004) SREBP transcription factors: master regulators of lipid homeostasis Biochimie 86:839-848 doi:10.1016/j.biochi.2004.09.018

Filella X, Foj L, Mila M, Auge JM, Molina R, Jimenez W (2013) PCA3 in the detection and management of early prostate cancer Tumour Biol 34:1337-1347 doi:10.1007/s13277-013-0739-6

Flier JS, Hollenberg AN (1999) ADD-1 provides major new insight into the mechanism of insulin action Proc Natl Acad Sci U S A 96:14191-14192

Foufelle F, Ferre P (2002) New perspectives in the regulation of hepatic glycolytic and lipogenic genes by insulin and glucose: a role for the transcription factor sterol regulatory element binding protein-1c Biochem J 366:377-391 doi:10.1042/bj20020430

Godinho M, Meijer D, Setyono-Han B, Dorssers LC, van Agthoven T (2011) Characterization of BCAR4, a novel oncogene causing endocrine resistance in human breast cancer cells J Cell Physiol 226:1741-1749 doi:10.1002/jcp.22503

Gutschner T, Diederichs S (2012) The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view RNA Biol 9:703-719 doi:10.4161/rna.20481

Horton JD, Goldstein JL, Brown MS (2002) SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver J Clin Invest 109:1125-1131 doi:10.1172/jci15593

Huttenhofer A, Schattner P, Polacek N (2005) Non-coding RNAs: hope or hype? Trends Genet 21:289-297 doi:10.1016/j.tig.2005.03.007

Kohjima M et al. (2008) SREBP-1c, regulated by the insulin and AMPK signaling pathways, plays a role in nonalcoholic fatty liver disease Int J Mol Med 21:507-511

Lerat H et al. (2009) Hepatitis C virus proteins induce lipogenesis and defective triglyceride secretion in transgenic mice J Biol Chem 284:33466-33474 doi:10.1074/jbc.M109.019810

Li B, Mao R, Liu C, Zhang W, Tang Y, Guo Z (2018) LncRNA FAL1 promotes cell proliferation and migration by acting as a CeRNA of miR-1236 in hepatocellular carcinoma cells Life sciences doi:10.1016/j.lfs.2018.02.006

Li D et al. (2017) Identification of a novel human long non-coding RNA that regulates hepatic lipid metabolism by inhibiting SREBP-1c International journal of biological sciences 13:349-357 doi:10.7150/ijbs.16635

Panzitt K et al. (2007) Characterization of HULC, a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma, as noncoding RNA Gastroenterology 132:330-342 doi:10.1053/j.gastro.2006.08.026

Ponting CP, Oliver PL, Reik W (2009) Evolution and functions of long noncoding RNAs Cell 136:629-641 doi:10.1016/j.cell.2009.02.006

Sekiya M et al. (2003) Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression Hepatology (Baltimore, Md) 38:1529-1539 doi:10.1016/j.hep.2003.09.028

Shimano H (2001) Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs): transcriptional regulators of lipid synthetic genes Prog Lipid Res 40:439-452

Shimano H (2002) Sterol regulatory element-binding protein family as global regulators of lipid synthetic genes in energy metabolism Vitam Horm 65:167-194

Shimano H et al. (1999) Sterol regulatory element-binding protein-1 as a key transcription factor for nutritional induction of lipogenic enzyme genes J Biol Chem 274:35832-35839

Shimomura I, Bashmakov Y, Horton JD (1999a) Increased levels of nuclear SREBP-1c associated with fatty livers in two mouse models of diabetes mellitus J Biol Chem 274:30028-30032

Shimomura I, Bashmakov Y, Ikemoto S, Horton JD, Brown MS, Goldstein JL (1999b) Insulin selectively increases SREBP-1c mRNA in the livers of rats with streptozotocin-induced diabetes Proc Natl Acad Sci U S A 96:13656-13661

Si Y et al. (2012) A human claudin-1-derived peptide inhibits hepatitis C virus entry Hepatology (Baltimore, Md) 56:507-515 doi:10.1002/hep.25685

Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS (2010) Non-coding RNAs: regulators of disease The Journal of pathology 220:126-139 doi:10.1002/path.2638

Wilusz JE, Sunwoo H, Spector DL (2009) Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world Genes Dev 23:1494-1504 doi:10.1101/gad.1800909

Xie H, Ma H, Zhou D (2013) Plasma HULC as a promising novel biomarker for the detection of hepatocellular carcinoma Biomed Res Int 2013:136106 doi:10.1155/2013/136106

Yahagi N et al. (2002) Absence of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) ameliorates fatty livers but not obesity or insulin resistance in Lep(ob)/Lep(ob) mice J Biol Chem 277:19353-19357 doi:10.1074/jbc.M201584200

Yamashita T et al. (2004) Role of uncoupling protein-2 up-regulation and triglyceride accumulation in impaired glucose-stimulated insulin secretion in a beta-cell lipotoxicity model overexpressing sterol regulatory element-binding protein-1c Endocrinology 145:3566-3577 doi:10.1210/en.2003-1602

Yan C, Chen J, Chen N (2016) Long noncoding RNA MALAT1 promotes hepatic steatosis and insulin resistance by increasing nuclear SREBP-1c protein stability Scientific reports 6:22640 doi:10.1038/srep22640

Zhang C, Yang X, Qi Q, Gao Y, Wei Q, Han S (2017) lncRNA-HEIH in serum and exosomes as a potential biomarker in the HCV-related hepatocellular carcinoma Cancer biomarkers : section A of Disease markers doi:10.3233/cbm-170727

Zhang H et al. (2015) Long non-coding RNA expression profiles of hepatitis C virus-related dysplasia and hepatocellular carcinoma Oncotarget 6:43770-43778 doi:10.18632/oncotarget.6087