益气活血中药治疗CHF大鼠CaSR及细胞凋亡的实验观察

宋婷婷，董波，辽宁中医药大学附属第二医院，110034

中文摘要

目的：本项目是观察益气强心饮干预慢性心衰模型大鼠钙敏感受体激活及心肌细胞凋亡的作用机制。

方法：采用腹主动脉缩窄改良术建立慢性心衰大鼠模型，按随机方法将大鼠分为假手术组、模型组、西药组、中药组，应用益气强心饮干预8周后，观察各组大鼠的钙敏感受体蛋白表达及心肌细胞凋亡指数。

结果：益气强心饮能明显降低慢性心衰模型大鼠心肌组织的钙敏感受体蛋白表达及细胞凋亡指数，与西药对照组疗效相当。

结论：益气强心饮可干预慢性心衰模型大鼠的钙敏感受体激活，可抑制慢性心衰模型大鼠的心肌细胞凋亡，证实益气强心饮有治疗慢性心衰及延缓心衰发展等作用。

关键词：钙敏感受体；细胞凋亡；益气强心饮；慢性心力衰竭。

Abstract

Objective: The purpose of this experiment was to observe the effect of  Yiqi  Qiangxin Yin on CaSR and the apoptosis in cardiac myocytes of rats with chronic heart failure.   methods: The establishment of chronic heart failure rat model by abdominal aortic constriction, were randomly divided into model group, western medicine  treatment group, Chinese medicine treatment group, Sham-operated group, after 8 weeks of treatment, the expression of myocardial cell apoptosis and CaSR protein of rats were observed.    Result：Yiqi Qiangxin Yin can obviously reduce the expression of CaSR protein expression in myocardial tissue of chronic heart failure rats , and reduce apoptosis, the curative effect is equivalent to western medicine  treatment group.   Conclusion: Yiqi Qiangxin Yin can regulate the apoptosis of myocardial cells in chronic heart failure rats, and has the function of treatment and delaying the development of heart failure.   Key words: CaSR；Apoptosis of myocardial cells；Chronic heart failure；Yiqi Qiangxin Yin.

慢性心衰(CHF)是临床常见病及多发病，是多种心血管疾病的严重和终末阶段^[1]。随着现今社会生活方式的改变和人口老龄化的日益加重，慢性心衰的患病率和病死率也逐年升高。流行病学调查报告显示，国外慢性心衰的发病率随年龄增加^[2]，65岁以上人群可达10%，，中国人群心衰发病率约为0.8‰，其中老年人心衰发病率显著高于中青年人^[3]，因此从慢性心衰的发病机制入手，根本上防治慢性心衰意义重大。目前研究表明细胞凋亡是心力衰竭发生、发展的重要机制^[4]，有效的干预细胞凋亡，可以预防心室重构，是防治慢性心衰的一条全新途径。而研究证实钙敏感受体（Calcium-sensing receptor，CaSR）参与细胞凋亡^[5、6、7]，如何在凋亡的早期，阻断CaSR途径介导的心肌细胞凋亡，进一步抑制、逆转心肌重构，从而达到改善心功能，延缓或逆转心衰的发生发展的作用，成为摆在我们面前的课题，因此本课题是应用益气强心饮干预慢性心衰模型大鼠的钙敏感受体激活及心肌细胞凋亡，从而揭示中药益气强心饮具有治疗及延缓心衰的发展等作用。

1 实验材料

1.1实验动物

选择雄性Wistar大鼠80只，SPF级，11±1周龄，体重200±20g，实验动物来源：辽宁长生生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001。所有大鼠以标准大鼠饲料适应性饲养1周。

1.2实验药品

中药：益气强心饮，由辽宁中医药大学附属第二医院煎药室制备，药物组成为制附子、黄芪、葶苈子、泽兰、丹参、红花等。

西药：卡维地洛片，北京巨能有限责任公司，生产批号：20150901；盐酸贝那普利片，上海新亚药业闵行公司，生产批号：150701。

1.3实验仪器设备及实验试剂

奥林巴斯BX51显微镜，由日本奥林巴斯生产；BCD-243KA超低温冰箱，由美国生产；LKBV型超薄切片机，由瑞典生产；TUNEL细胞凋亡试剂盒，CaSR免疫组化试剂盒，CaSR抗体，细胞裂解液等购于武汉博士德生物技术有限公司。取材器械由上海医疗器械制造厂生产。

2 实验方法

2.1 CHF大鼠模型的建立

根据文献^[8、9]，结合预实验经验，我们采用腹主动脉缩窄改良术式建立 CHF大鼠模型，大鼠经3.5%水合氯醛腹腔麻醉（1ml/100g）麻醉后，麻醉大鼠采用左侧卧位，于大鼠右侧髂腰区备皮，在右肾于右髂腰区的体表投影为中心，作一长2-3cm的纵行切口，钝性分离皮肤、筋膜及肌肉，剪开右肾脂肪囊，轻轻牵拉右肾，暴露肾门背侧，沿右肾动脉寻找右肾动脉与腹主动脉的分叉点，在分叉点上方2mm处分离腹主动脉，然后用外科缝线将一根8#针头与该段腹主动脉一起结扎，再将针头抽出，造成结扎处腹主动脉内径缩窄，假手术组仅分离腹主动脉，但不予以结扎，然后依次还纳各脏器，关腹，缝合切口。术后5天连续予青霉素10000u/只肌肉注射，预防大鼠术后感染。

在实验大鼠腹主动脉结扎4周后，如大鼠出现如呼吸急促、心动过速和劳力性呼吸困难等失代偿性症状，同时完善心脏彩超检测，若EF＜50% ，则CHF大鼠模型造模成功。

2.2实验分组及实验给药

80只大鼠随机分为假手术组20只，手术组60只，按上述方法造模后，假手术组死亡2只大鼠，手术组死亡14只，筛选手术组中具有慢性心衰典型表现的大鼠38只，随机分为模型组12只，中药组13只，西药组13只，加上假手术组的大鼠18只，共4组。各组动物于同等条件下饲养，中药组予益气强心饮，用药量为生药22g /(kg•d)，西医组予卡维地洛6mg/(kg•d)，贝那普利10mg/(kg•d)，按1ml/100g灌服溶液，每日一次；假手术组与模型组灌服等量生理盐水，每日一次，共8周。

2.3实验指标测定

2.3.1大鼠心功能测定

各组大鼠在用药前及用药8周后均完善心脏超声检查。大鼠称重后，腹腔注射氯胺酮（75mg／kg）和地西泮（5mg／kg），仰卧位固定，胸部备皮，涂耦合剂。使用Vevo 2100 超声仪MS-250心脏探头，频率13-15MHz，参照文献方法，在左室内径最大处将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M型超声心动图，连续3次测量左心室舒张末期及收缩末期内径( LVIDD， LVIDS)，取其平均值。同时计算左心室射血分数(EF%)及左心室短轴缩短分数(FS%)。

2.3.2 TUNEL法测定大鼠心肌细胞凋亡的数量

实验具体步骤按照细胞凋亡试剂盒 (武汉博士德生物技术有限公司) 操作。光镜下观察正常心肌细胞核呈蓝色，为阴性反应。凋亡细胞核呈深浅不一的颗粒状红色，为阳性反应。根据凋亡阳性细胞在400高倍镜视野下的分布情况，每组标本观察5 张切片，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野计数100个心肌细胞，记录其中TUNEL阳性细胞总数，并以每100个细胞中的阳性数为凋亡指数 (apoptotic index，AI)。

2.3.3大鼠心肌CaSR的Western blot 检测

实验具体步骤按照CaSR的Western blot 检测试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）操作。取0.1g心肌组织低温研磨后，加入蛋白裂解液，充分裂解后，4℃条件下1400g离心15min，取上清。以BSA为标准蛋白，用Bradford法对所取上清进行蛋白定量。取20ug蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳，然后用100V，时间1h，转印至硝酸纤维素膜上。该膜浸没在Western blot封闭液中（TBST溶解的5%脱脂奶粉，PH7.4），37℃封闭1h，加入CaSR抗体（1:2000）中孵育过夜。TBST反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶标记的抗Ig抗体（1:1000）孵育，37℃轻摇1h，再反复洗膜，之后用Western blue 显迹，同时用β-actin抗体（1:500）为内参，用不加CaSR抗体的作为阴性对照。

2.4实验数据统计

所有实验数据均以均数加减标准差（X±S）表示，组间比较用方差分析，统计软件为SPSS 15.0版本，P<0.05为有差异性，具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠心功能测定

造模后检测假手术组与手术组大鼠的结构变化和心功能。与假手术组相比，手术组的大鼠 LVEF 明显下降，P<0.05，有统计学意义；手术组与假手术组相比，FS明显降低， P<0.05，有差异性，有统计学意义；与假手术组相比，手术组的 LVIDd 升高， P<0.05，有统计学意义；两组 E/A 值相比 P<0.05，具有统计学意义。（表1、图 1）  

表 1  两组大鼠超声结果（X±S）

P<0.05 为有差异性，具有统计学意义。*与手术组相比 P<0.05。

图1  两组大鼠心脏超声结果

假手术组                                  手术心衰组                

2.2各组大鼠心肌组织CaSR蛋白的表达

各组CaSR蛋白表达的比较（CaSR/GAPDH）（见表2），假手术组与其它各组比较，心肌细胞的CaSR蛋白含量较低，P<0.05具有差异性，有统计学意义；模型组与其它各组比较，心肌细胞CaSR蛋白含量较高，P<0.05，具有统计学意义，同时中药组与西药组相比，P>0.05，无显著差异性，说明中药组和西药组心肌细胞CaSR蛋白含量相当。从 CaSR电泳图（图 2）也可以看出，模型组的电泳条带最宽，而假手术组最窄，中药组和西药组次之，GAPDH各组之间宽窄程度均一。

表 2   各组 CaSR 蛋白表达的比较（X±S）

P<0.05 为有统计学意义，*与假手术组比较，P<0.05，#与模型组比较，P<0.05，△与中药组比较，P>0.05。

图2  各组 CaSR 蛋白表达

2.3各组大鼠心肌组织细胞凋亡结果

在显微镜下观察，正常的细胞核不被染色因而看不到，而经TUNEL法染色后，凋亡的细胞核呈棕黄色。各组的心肌细胞凋亡指数见表 3。

表3  各组心肌细胞凋亡指数（X±S）（%）

P<0.05 具有统计学意义，*与假手术组比较，P<0.05，#与模型组比较，P<0.05，△与中药比较，P>0.05。

由上表可以看出假手术组与各组比较，心肌细胞凋亡指数最低，P<0.05，有统计学意义；模型组与中药组、西药组比较，模型组心肌细胞凋亡指数最高，而中药组和西药组次之，P<0.05，有统计学意义；而中药组与西药组比较，P>0.05，无明显差异性，说明两组心肌细胞凋亡指数相当。

3 讨论

随着城市建设的日新月异和社会老龄化的来临，心血管疾病的危险因素急剧增加，心衰的患病率和病死率呈现快速增长的趋势^[10、11]，《中国心血管病报告2016》中提到我国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，推算我国的心力衰竭患者高达 450 万，慢性心衰患者的平均发病年龄呈上升趋势，为66±15岁，心血管病死亡率仍高居首位^[12]，而心衰是导致心脏病患者死亡的最主要原因，心衰患者5年内的死亡率约为50%^[13、14]。防治心衰成为了治疗心血管疾病的重中之重。

如今慢性心衰研究日益深入，早已从体液潴留、泵功能障碍学说过度到现在的神经内分泌系统过度激活等导致的心室重构学说，而心肌细胞凋亡就参与其中，是慢性心衰发生、发展的重要机制^[15]。细胞凋亡是细胞程序性死亡，对细胞的生长和发育起着重要的作用^[16]，心肌细胞凋亡时大量心肌细胞减少，心肌细胞的减少会导致心脏泵功能的丧失，而细胞凋亡后，在凋亡附近的细胞重排，发生心肌重构，重构也会使心脏收缩功能进一步下降。如果能在早期阻断细胞凋亡，就可以延缓或逆转心衰的发生发展。

CaSR作为G蛋白偶联受体超家族中C家族的成员之一，主要是调控机体钙平衡^[17]。近年来研究证实CaSR通过激活Fas/FasL的受体通路，促进心肌细胞凋亡^［18］，CaSR能直接诱发细胞内钙超载，导致心肌细胞凋亡^［5］，CaSR可通过肌浆网上的IP3受体释放大量钙离子，进入线粒体后引发心肌细胞^［19］，CaSR还可诱导内质网紧张，通过内质网通路促进心肌细胞凋亡，从而导致心衰的发生发展^［6］。可见我们能有效的控制CaSR过度激活，阻断其传导通路，那么就可以有效的抑制细胞凋亡，从而抑制慢性心衰的发展，达到治疗及延缓心衰的目的。

我们通过本实验发现CHF时模型组大鼠心肌组织的CaSR蛋白表达与假手术组比较明显升高 (P＜0.05)，同时模型组大鼠心肌细胞凋亡指数与假手术组相比也具有统计学意义(P＜0.05），两者升高具有同步性。这证实了细胞凋亡参与慢性心衰的发生、发展，同时CaSR参与了心肌细胞凋亡过程。本实验证实了①中药益气强心饮确实能够明显下调CaSR蛋白表达，与模型组相比，P＜0.05，具有统计学意义，中药组和西药组相比较P＞0.05，证明疗效相当；②中药组和西药组与模型组相比，心肌细胞凋亡指数均有下降，P＜0.05，有统计学意义，中药组和西药组相比P＞0.05，证明两者作用相似。上述实验结果提示了中药益气强心饮可下调慢性心衰大鼠心肌组织钙敏感受体蛋白表达及心肌细胞凋亡指数，疗效等同西药对照组。这证实了益气强心饮可抑制心肌细胞凋亡，具有治疗及延缓心衰的发展等作用。

慢性心衰的中医病机应为本虚标实之证，以气虚、阳虚为本，以血瘀、水停为标，治疗原则以益气温阳，活血利水为主，其中益气温阳为治病之根，活血利水为治病之要，二者缺一不可。益气强心饮是我们在多年临床经验基础上改进完善而创立的经验方，在前期工作中，我们已通过临床反复论证，证实益气强心饮可改善慢性心衰患者临床症状，降低心衰患者BNP水平，提高6分钟步行试验距离^［20］。益气强心饮主要由红参、黄芪、制附子、泽兰、葶苈子等药物组成，具有益气温阳、活血利水之功效，全方可益气活血，气充血行，温阳利水，阳充水散，具有标本并治之功，且以补为通，补中寓通，通补兼施，相得益彰。

本实验证实了中药益气强心饮可干预慢性心衰时CaSR的激活及心肌细胞凋亡，可改善心功能、抑制心肌重构、治疗及延缓心衰的发生发展，从而揭示中药益气强心饮具有抗心衰的作用，在慢性心衰治疗方面有着广阔的前景，为中医药治疗慢性心衰提供崭新的思路及理论依据。

参考文献：

1.中华医学会心血管病学分会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2014[J].中华心血管病杂志，2014(2)，42(2): 98-122.

2.Mosterd A, Hoes A W. Clinical epidemiology of heart failure. Heart 2007，93(9): 1137-1146.

3.黄俊.中国心力衰竭流行病学特点和防治策略.中华心脏与心律失常电子杂志，2015,3（2）：2-3.

4. Consili C，Gatta L，Iellamo F，et al.Severity of left ventricular dysfunction in heart failure patients affects the degree of serumin duced cardiomyocyte apoptosis. Importance of inflammatory response and metabolism［J］．Int J  Cardiol，2013，167（6）：2859-2866.

5.Zhang L，Cao S，Deng S，et al.Ischemic postconditionging and pinacidil suppress calcium? Overload in anoxia-reoxygenation cardiomyocytes via down-regulation of the calcium-sensing receptor [J].Peer J，2016，11(4):e2612

6.张伟华，于雪，王景晓，等．钙敏感受体通过调控线粒体内钙参与心肌细胞缺氧－复氧损伤所致的凋亡. 哈尔滨医科大学学报，2012，46（6）：534-538.

7. 闫学晶，杨丹，李智敏，等.钙敏感受体在阿霉素诱导大鼠心肌损伤过程中的表达.哈尔滨医科大学学报，2013，47（1）：38-42

8.汪谦.现代医学实验方法[M].北京:人民卫生出版社，2009:843.

9.徐攀,许海顺,陈京,张春椿,熊耀康.慢性心力衰竭心阳虚证大鼠模型的建立与评价研究[J].中华中医药学刊,2016,34(08):1957-1960.

10.Redfield MM，Jacobsen SJ，Burnett JC，et al. Burden of systolic and diastolic ventricular dysfunction in the community:appreciating the scope of the heart failure epidemic. JAMA 2003，289: 194-202.

11.Bleumink GS，Knetsch AM，Sturkenboom MCJM， et al. Quantifying the heart failure epidemic: prevalence，incidence rate，lifetime risk and prognosis of heart failure The Rotterdam Study. Eur Heart J England，2004，25：1614-1619.

12.陈伟伟，高润霖，刘力生，等.《中国心血管病报告2016》概要.中国循环杂志，2017,32（6）：521-530.

13.Levy D，Kenchaiah S，Larson MG，et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. N Engl J Med. 2002，347：1397-1402.

14.Roger VL，Weston SA，Redfield MM，et al. Trends in heart failure incidence and survival in a community-based population. JAMA 2004，292: 344-50.

15.Narula J, Haider N, Virmani R, et al. Apoptosis in end-stage heart failure[J].N Eng J Med,1996,335: 1182-1189.

16.COHEN G M，MACFARLANE M，SUN X M，et al．Caspases and apoptosis［J］．Eur J Cancer，2015，35(1) :9-19．

17.Diez-Fraile A，Lammens T，Benoit Y，et al．The calcium-sensing receptor as a regulator of cellular fate in normal and pathological conditions［J］．Curr Mol Med，2013，13(2) : 282-295．  

18.董波，宋婷婷，董天宝，等.益气强心饮对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡及Fas、 FasL基因蛋白表达影响的实验研究．中华中医药学刊，2010，28（10）：2075-2077.

19.郭津，顾镜月，王鲁川，等. 动脉粥样硬化大鼠心肌梗死时钙敏感受体表达的变化及其作用机制. 现代生物医学进展，2016，16（24）：4631-4635.

20.董波，王东海，宋婷婷，等.益气强心饮对慢性心衰病人血浆BNP及6min步行试验距离的影响. 中华中医药学刊，2012，30（12）：2740-2742.

课题来源：辽宁省自然基金 (No.2014020161)； 课题名称：钙敏感受体参与慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的机制研究。