奶牛乳房炎的微生物学诊断及综合防治

黄恩霞¹，庞照霞¹，李甜，张耀相

（西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100）

摘要：陕西某牛场发生奶牛乳房炎，从发病症状典型的病牛牛乳中无菌操作采样，接种培养分离细菌，分离一株革兰阴性细菌（G^-），通过细菌生物学特性检验、生理生化试验以及动物致病性试验，从中鉴定出致病菌大肠埃希菌（Escherichia coli）。通过药敏试验，发现此细菌对诺氟沙星、氧氟沙星、大观霉素、庆大霉素、环丙沙星等抗生素敏感，对链霉素、苯唑西林、麦迪霉素、复方新诺明、万古霉素等抗生素有耐药性，经腹腔注射对小鼠有一定的致病作用。

关键词：奶牛乳房炎；大肠埃希菌；分离与鉴定；药敏试验

Microbiological diagnosis and comprehensive prevention of cow mastitis

Huang Enxia ¹, Pang Zhaoxia ¹, Li Tian, Zhang Yaoxiang

（Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100）

Abstract: Dairy cow mastitis occurs in a cattle farm in Shaanxi. Samples are taken from the aseptic symptoms of typical diseased cow's milk. The bacteria are isolated and cultured,Isolation of a gram-negative bacterium. The pathogenic bacteria Escherichia coli was identified by bacterial biological property test, physiological and biochemical test and animal pathogenicity test. (Escherichia coli). Through susceptibility testing, the bacteria were found to be sensitive to antibiotics such as norfloxacin, ofloxacin, spectinomycin, gentamicin, and ciprofloxacin. For streptomycin, oxacillin, medimycin, and compound Antibiotics such as sulfamethoxazole and vancomycin are resistant.

Key words: Dairy cow mastitis; Escherichia coli; isolation and identification; drug sensitivity test

奶牛乳房炎发病率较高，若不提前预防及时治疗，会导致奶牛的生产性能下降，可能给奶牛产业带来了较大的经济损失。奶牛乳房炎的病因复杂，主要是各种原因引起的病原微生物感染，大肠埃希菌便是主要的病原微生物之一。奶牛乳房炎的症状相对明显比较容易观察，结合临床症状和微生物学诊断，及早发现并及时运用有效药物对其治疗，尽可能将损失降到最低。本病例奶牛乳房炎以乳房发炎，产奶量减退，乳汁发生变质，奶牛食欲减退为主要临床症状。在采样的病奶牛的乳液中分离到了一株致病菌，对其进行实验室微生物学诊断，诊断为大肠埃希菌(Escherichia coli)。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1病料无菌操作采取自陕西某奶牛场得乳房炎的奶牛乳汁。

1.1.2实验分离所用培养基 普通琼脂平板培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁生化培养基、绵羊血琼脂平板培养基、伊红-美兰琼脂培养基、柠檬酸盐斜面培养基等（按照参考文献^[5]介绍的方法制备）。

1.1.3药敏试验用抗生素纸片(购自杭州微生物试剂有限公司。批号：2018006023 )

试验动物 小白鼠（由西北农林科技大学实验动物中心提供）。

其他操作材料与实验条件均由西北农林科技大学兽医微生物实验室提供。

1.2方法

1.2.1细菌分离 超净工作台上无菌取病料，接种环分别划线接种于普通琼脂平板培养基、麦康凯琼脂平板培养基以及绵羊血琼脂平板培养基，并做好标记，37℃培养24h~36h后，将生长出来的可疑菌落无菌分离培养挑纯4℃保存待用。

1.2.2形态与染色  取可疑菌，采用革兰染色在显微镜下观察其形态结构及染色特性。

培养特性 根据染色镜检结果，选取后期所用培养基并制定鉴定计划后，分离菌株接种于普通琼脂平板培养基、麦康凯琼脂平板培养基、普通肉汤等培养基中，37℃培养24~36h后，观察生长状况。将纯菌挑取菌落接种于普通肉汤培养基37℃培养24~36h后，4℃保存备用。

1.2.3生化试验 用分离得的纯菌落穿刺接种于柠檬酸盐培养基、先划线后穿刺接种于三糖铁生化培养基，注意穿刺不要穿透到底部或者穿到试管壁。并进行糖发酵试验、靛基质试验、甲基红试验等，37℃培养24h观察并记录结果。

1.2.4药敏试验 对分离得到的肉汤纯培养物用麦氏比浊法进行浓度测定后，将其浓度调整至3~4*10^8个/ml,再用抗生素纸片扩散原理进行药敏试验，用无菌棉签均匀涂抹于普通琼脂培养基，然后在其表面贴药敏片，做好记录。37℃培养24h~36h后，观察实验结果并记录。

1.2.5动物致病性试验 取小白鼠若干只，分为实验组1、实验组2、对照组。将肉汤培养物经麦氏比浊管比浊后调整为9*10^8个/ml。分别给三组小鼠腹腔注射0.2ml肉汤培养物、0.4ml肉汤培养物、0.2ml灭菌营养肉汤。于12h、24h、36h、48h观察小鼠发病及死亡情况，待小鼠死亡后便可剖检小白鼠，观察并无菌采集肝脏、脾脏等脏器，对感染的细菌进行鉴定。

1.3结果

1.3.1形态及染色特性 从病料中分离的细菌接种于普通琼脂平板培养基37℃下培养24h后可见中等大小、灰白色、光滑菌落。接种于麦康凯琼脂平板培养基在37℃下培养24h可见浅红色、光滑菌落。接种于三糖铁培养基在37℃培养24小时后可见斜面黄色、底部黄色有黑色气体产生。接种于绵羊血琼脂平板37℃下培养24h后可见有α型溶血现象。革兰染色镜检观察该菌为革兰阴性（G^-）杆菌，成对或散在排列，无芽胞，周生鞭毛。

1.3.2生化特性观察

生化试验 见表1。

表格 1 分离株生化试验结果

注：“+”表示发酵产酸；“-”表示不发酵；“+”表示发酵产酸产气

1.3.3药敏试验 见表2。

表格 2 分离菌株药敏试验结果

注：d≥20mm，高度敏感；10mm≤d<20mm，中度敏感；d<10mm，耐药。

1.4动物致病性试验 实验组小鼠在注射可疑菌后24h，小鼠出现精神沉郁，被毛凌乱，食欲下降。48h后将对照组小鼠处死，未出现明显的病变。对照组小鼠无明显临床症状。分别无菌采集对照组和实验组肝脏、脾脏接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂平板，37℃培养24h，在实验组可在麦康凯普通琼脂培养基分离到浅红色、光滑、湿润、中等大小菌落，经染色镜检，可见革兰阴性（G^-）杆菌,经鉴定是大肠埃希菌(Escherichia coli)，与感染菌相同，对照组未分离出感染细菌。

2讨论与分析

2.1结论

经过细菌生物学特性的鉴定、生化试验及动物致病性试验，鉴定此菌株为大肠埃希菌（Escherichia coli）。

2.2讨论

引起奶牛乳房炎的因素有很多，比如奶牛场的饲养管理条件不当可能会引起乳房感染；厩舍卫生条件不良、挤奶卫生不注意等也可能造成乳房感染；外界环境引起奶牛的自身抵抗力下降等也会加大感染的机会。

奶牛乳房炎的治疗，应选用敏感抗生素，同时结合临床症状再进行辅助治疗。另外黄连、黄芩、双黄连等中药对临床奶牛乳房炎乳源大肠埃希菌具有一定的体外抑制作用^[6]。在临床工作中，养殖场一旦发病，需要及时采样进行微生物诊断，尽早进行有效控制和治疗。但通常微生物培养鉴定的时间较长，所以在临床实际运用时可根据具体情况进行药敏试验，先用敏感抗生素进行治疗，待确定诊断结果后再使用更全面的治疗方案。

在实验采样过程中，应严格遵守无菌操作，要先对奶牛乳房部位进行消毒，弃掉前三把乳样，采样容器、培养基应严格无菌，避免污染。在实验过程中不一定要严格按照书上所写的规格，要根据具体情况进行变通，比如为确保致病菌能够在培养基上充分生长，制作培养基可加入较多的牛肉膏保证较好的营养。

药敏试验表明，大肠杆菌对多数抗生素有耐药性，说明临床对发病牛没有用正确抗生素进行治疗，使细菌产生细菌耐药性，临床使用抗生素时应注意减少抗生素滥用。该菌对大观霉素、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星等中度敏感，建议应用于临床治疗，同时应注意配合交替用药以降低耐药性的产生概率，也要注意加强饲养管理，防止继发感染。

引起奶牛乳房炎的病原有细菌、真菌、支原体、病毒等，临床上若遇到病例时，应同时开展常见细菌、病毒、厌氧菌以及支原体检验，以全面更快速的查明病因。在本次乳房炎的微生物诊断过程中没有对支原体、真菌、病毒等微生物同时行分离鉴定，因此该奶牛场乳房炎是否有其他病原微生物的混合感染，还有待进一步的研究。

病原微生物分离鉴定的方法对于临床传染较快、危害较大的疾病来说，鉴定较慢，所以在紧急情况下，可使用一些新兴的快速诊断技术。血液的血常规分析，牛乳的急性期蛋白，乳酶以及其他乳成分的分析进行快速诊断、乳中体细胞直接计数法（SCC）也可作为一个重要的诊断依据、PCR诊断技术等，同时还可以利用这些技术发现患有隐性乳房炎的奶牛，可提前预防发病。

3 致谢：

衷心感谢高级实验师张耀相老师在文章完成过程中的一切支持和帮助！在此表示衷心感谢！

4 参考文献：

[1]陆承平. 兽医微生物学（第四版）[M]. 中国农业出版社, 2007.

[2]王建华.兽医内科学（第四版）[M]. 中国农业出版社, 2006.

[3]陈溥言.兽医传染病学（第六版）［M］.中国农业出版社，2015.

[4] 李建强.李六金.兽医微生物学实验实习指导［M］.陕西科技出版社，1999.

[5]张耀相,乔海莲,刘岳,高娴,蒋朋飞.奶牛继发性大肠埃希菌病的微生物学诊断及综合防治[J].黑龙江畜牧兽医,2014(10):78-79.

[6]赵秋云.中药对临床型奶牛乳房炎源大肠杆菌的体外抑制及耐药消除研究[D].西北农林科技大学,2017.