四川解剖学稿件信息
UPLC-MS/MS测定动物源性肌肉内硝基呋喃代谢物的方法优化
张加稳
（昆明市食品药品检验研究院）
[摘 要]目的：建立高效液相-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测动物源性肌肉内硝基呋喃代谢物快速高效的提取方法。方法：混合加标样品经水解及衍生化后，分别用液相萃取法和固相萃取法提取，再用HPLC-MS/MS内标法定量分析其回收率的高低。结果：检出限均达到0.3μg/kg，在0.5~100ng/mL的线性范围内，相关系数均大于0.99，液相萃取法和固相萃取法两种提取法的平均回收率分别为86.0%~104.0%；68.0%~87.2% ，RSD均小于10%。结论：液相萃取法提取动物源性肌肉内硝基呋喃代谢物残留量提取效率更高， 更能满足样品检测的定性、定量要求。
关键词： 动物源性肌肉；硝基呋喃代谢物；高效液相色谱-串联质谱；液相萃取法；固相萃取法
Method optimization of the determination of nitrofuran metabolites in animal-derived muscle by UPLC-MS/MS
Abstract: Objective:Provide a more suitable pretreatment method for the determination of nitrofuran metabolites in animal-origin foods by using HPLC-MS / MS. Methods:The mixed spiked samples were hydrolyzed and derivatized, and then extracted by liquid phase extraction and solid phase extraction respectively,and quantitatively analyze the recovery rate by internal standard method of HPLC-MS/MS. Results: The detection limits were all up to 0.3μg/kg, and the correlation coefficients were all greater than 0.99 in the linear range of 0.5 to 100 μg/kg.The recovery rate of liquid extraction and solid phase extraction was 86.0%~104.0%, 68.0%~87.2% respectively, and the RSD were both less than 10%. Conclusion: The recovery rate of nitrofuran metabolites from animal-origin muscles by liquid extraction method is higher, which is more able to meet the qualitative and quantitative requirements of sample testing.
Keywords: Animal-origin muscle;Nitrofuran metabolites;High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry( HPLC-MS/MS); Liquid phase extraction;Solid phase extraction
硝基呋喃类药物(Nitrofurans)是人工合成的含硝基广谱抗生素[1]，主要分为呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃妥因(Furantoin,NFT)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)和呋喃它酮(Furaltadone，FTD)4类[2]，因其具有较好的抗菌消菌效果且价格较低而被广泛用于动物饲料添加剂来预防和治疗动物胃肠道疾病[3]。研究显示，硝基呋喃类抗生素在动物体内极不稳定，代谢迅速，不易被检测，数小时内即可代谢降解成为3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amina-2-oxazolldinone,AOZ)、1-氨基-2-乙内酰(1-Aminnohydantoin,AHD)、氨基脲(semicarbazide,SEM)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(3-amina-5-methyl-2-oxazole morpholine generation ketone of alkanes，AMOZ)等稳定残留代谢物，这些硝基呋喃代谢物会与细胞膜蛋白结合残留于组织肌肉中，残留时间达数周且非常稳定，高温烹饪都无法使其有效分解[4-6]。通常采用检测代谢物含量反应硝基呋喃药物残留情况[7]，其具有慢性毒性，会引发消化道反应，甚至具有致畸，致癌作用[8-9]。因此，1990年欧盟颁布相关条例已禁止使用硝基呋喃类药物，2003欧盟又颁布了条列规定用于禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物及代谢物的各种检测方法的最小要求能限值（minimum required performancelimits,MRPL）为1.0μg/kg[10]。美国、日本与韩国也在1975、1977、2002年规定在肉制品中不得检出呋喃唑酮，2002年4月中国农业部也在《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》（农业部公告193号）中将其列为禁用药物，2003年又将硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划中，中国卫生部2010年将硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质黑名单[10-12]。
早期，硝基呋喃类抗生素残留的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱-紫外光谱法（HPLC-UV）、酶联免疫法(ELISA)，而目前高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)已成为主要检测方法，但所报道的样品前处理方法差异较大，故本文采用HPLC-MS/MS法来验证固相萃取法和液相萃取法对样品前处理后目标物回收率的高低，旨在为硝基呋喃类抗生素残留量的检测提供理论指导。
1 材料与方法
1.1试剂与材料
试剂：甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸均为色谱级，浓盐酸、氢氧化钠、邻硝基苯甲醛、三水磷酸钾、乙酸铵均为分析纯。
标准物质：3-氨基-2-恶唑酮、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮、1-氨基-2-乙内酰、氨基脲，纯度≥99%；D4-AOZ、13C-AHD、13C15N-SEM、D5-AMOZ，纯度≧95%，购自农业部环境保护科研监测所。
材料：C18色谱柱(1.8um×2.1×50mm，Agilent)、CaptiveEMR固相萃取小柱、PES滤膜
1.2仪器与设备
高效液相-质谱联用仪EXION-QTRAP4500（AB公司）、C18色谱柱(1.8um×2.1×50mm，Agilent)、高速离心机、涡旋振荡器、电子天平、精密移液枪、氮吹仪、恒温水浴锅、组织捣碎机、pH计：测量精度为±0.02 pH
1.3方法与过程
1.3.1标准溶液的配制
准确取500ng/mL混合中间标准溶液和1μg/mL混合内标液用50%乙腈依次稀释成0.5ng/mL、1ng/mL，5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合系列标准溶液，内标液浓度为10ng/mL。
1.3.2 样品前处理对比研究
1.3.2.1水解及衍生化
将动物肌肉切碎，称取约2g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入甲醇-水混合溶液（体积比1:1）10mL，振荡10min后以4000r/min离心5min，弃去上层液体，残留物体里加0.2mol/L盐酸（准确量取浓盐酸17mL，用水定容至1L）10mL，10000r/min均质1min，依次加入混合内标溶液100μL和邻硝基苯甲醛100μL，涡动混合30s，再振荡30min，置于37℃恒温箱中（反应16小时）。
1.3.2.2提取和净化—液相萃取法
取出样品，冷却至室温，加入0.3mol/L磷酸钾1mL，再用2.0mol/L氢氧化钠调节pH至7.2，加入10mL乙酸乙酯涡旋振荡10min，再以10000 r/min低温离心10min，将乙酸乙酯层取出移至另一只离心管中，残留物中加入10mL乙酸乙酯再提取一次，合并两次乙酸乙酯提取液，在40 ℃下用氮气吹干，残留物加1mL 0.1%甲酸水溶液溶解并过0.22μm PES滤膜后直接进HPLC-MS/MS待测。
1.3.2.3提取和净化—固相萃取法
取出样品，冷却至室温，加入0.2%甲酸乙腈4mL，用陶瓷均质机涡旋1mi ，低温离心10min，将上清液移至另一试管中，用4mL 5%甲酸乙腈重复提取一次，振荡1min，静置10min，用10000 r/min 低温离心10min，合并上清液，用乙腈定容到12mL，混匀，低温离心10min，取3mL上清液直接过CaptiveEMR固相萃取小柱，先用2mL超纯水淋洗两次，最后用5mL的乙腈洗脱2次，洗脱液于40℃下用氮气吹至近干，再用1mL 20%乙腈水溶液溶解，过0.22μmPES滤膜后直接进HPLC-MS/MS待测。
1.3.3色谱条件
液相色谱条件：流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；
流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，洗脱梯度见表1。
表1 梯度洗脱条件
|
时间/min |
流动相A(乙腈） |
流动相B（0.1%甲酸水溶液） |
|
0 |
10% |
90% |
|
0.5 |
10% |
90% |
|
8.0 |
85% |
15% |
|
9.0 |
85% |
15% |
|
9.1 |
10% |
90% |
|
11.0 |
10% |
90% |
1.3.4质谱条件
ESI-MS/MS条件：正离子扫描；MRM多反应监测；气帘气，离子源雾化气，离子源辅助加热气，分别设定为30，50，50，喷雾电压5500V，加热器温度为550℃。分别用50%乙腈将混合中间标准溶液稀释成约为200ng/mL的溶液，恒流注射进样，分别扫描各对照品母离子Q1和子离子Q3，优化离子质荷比、去簇电压、碰撞电压等参数，选用2个离子对作为定性和定量离子，建立质谱检测方法，各成分优化结果见表2。
表2 各成分优化结果表
|
|
衍生物名称 |
母离子m/z |
子离子m/z |
驻留时间/ms |
锥孔电压/V |
碰撞能量(V) |
|
呋喃唑酮 |
AOZ |
235.9 |
103.9 |
60 |
60 |
14 |
|
134.1a |
60 |
60 |
12 |
|||
|
|
D4-AOZ |
240 |
134 |
60 |
60 |
12 |
|
呋喃妥因 |
AHD |
249 |
104a |
60 |
50 |
15 |
|
134 |
60 |
50 |
20 |
|||
|
|
13C-AHD |
252 |
184 |
60 |
50 |
18 |
|
呋喃西林 |
SEM |
209 |
166a |
60 |
70 |
12 |
|
192 |
60 |
70 |
15 |
|||
|
|
13C15N-SEM |
212 |
168 |
60 |
70 |
12 |
|
呋喃它酮 |
AMOZ |
335.1 |
262 |
60 |
60 |
10 |
|
291a |
60 |
60 |
11 |
|||
|
|
D3-AMOZ |
340 |
296 |
60 |
60 |
13 |
注：标注a为标准物质定量离子对
2 结果与分析
2.1 HPLC-MS/MS条件的优化
本研究采用C18色谱柱(1.8um×2.1×50mm，Agilent)，流速为0.2mL/min，柱温为40℃，进样量为10μL，分别对甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5mmol乙酸铵水溶液等流动相进行优化，结果表明流动相为乙腈-0.1%甲酸水时的色谱峰强度更高，其对称性和半峰宽也更窄，4个色谱峰保留时间均为7.3min左右，分离度较差，考虑到质谱定性定量对分离度要求较低没有进一步优化，今后研究中可考虑采用柱长更长和分离效果更好的填料色谱柱进行实验，也可对洗脱液梯度进行优化。将优化好的色谱和质谱条件建立仪器方法后对混合系列标液进行数据采集，4种化合物色谱图结果如下：
SEM：209＞166，192
AMOZ：335.1＞262，291
AAOZ：235.9＞104，134
AHD：249＞104，134
2.2 本文分别对50ng/mL混合标准液中加入50μL、100μL、200μL邻硝基苯甲醛衍生剂的量进行研究，结果表明加入50μL衍生后的样品目标峰强度较弱，加200μL衍生后的样品目标色谱峰找不到，而加100μL衍生后的样品目标峰强度最强。原因可能是硝基呋喃类代谢物的分子量较小，加入适宜量的邻硝基苯甲醛衍生剂可提高质谱检测灵敏度，加入量太大可能导致样品背景离子较强，目标物色谱峰会被掩盖，加入量太小又可能导致衍生化不充分。此外，本文还分别对样品衍生溶液中分别加入10mL 0.2mol/L盐酸溶液和纯水进行研究，结果表明前者衍生效果明显强于后者，原因可能是硝基呋喃类代谢物以蛋白结合形态存在于肌肉组织中，酸性环境可使样品水解分离出更多衍生物。
2.3 标准曲线和检出限
混合标准工作溶液各浓度平行进样3针，以峰面积对浓度做线性回归，得回归方程和相关系数，以信噪比为1:3时对应的标液浓度作为检出限(LOD)。结果表明，在线性范围（0.5~100ng/mL）具有良好线性关系，均大于0.99，AMOZ、AOZ、SEM和AHD检出限(LOD)均为0.3μg/kg，结果见表3。
表3 回归方程和相关系数
|
化合物 |
线性方程 |
线性范围(ng/mL) |
相关系数(r2) |
检出限(μg/kg) |
|
AOZ |
|
0.5-100 |
0.99910 |
0.3 |
|
AHD |
|
0.5-100 |
0.99927 |
0.3 |
|
SEM |
|
0.5-100 |
0.99942 |
0.3 |
|
AMOZ |
|
0.5-100 |
0.99633 |
0.3 |
2.4方法回收率和精密度
为了探索两种方法提取效率的高低，分别考察了在空白样品中添加4种硝基呋喃代谢物0.5μg/kg、1μg/kg，、5μg/kg三个浓度水平的回收率，每个浓度水平做6个平行实验，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD，n=6)，结果如表4、表5所列。
表4 液相萃取法加标回收率实验(n=6)
|
化合物 |
添加浓度水平(μg/kg) |
平均测定浓度/(μg/kg) |
平均回收率/% |
相对标准偏差/(RSD，%) |
|
SEM |
0.5 |
0.48 |
96.0 |
2.3 |
|
1.0 |
0.93 |
93.0 |
4.2 |
|
|
5.0 |
4.89
|
