A、C型魏氏梭菌的毒力测定

孔庆娟

（长治职业技术学院，山西长治，046000）

摘　要：作者对从山西省各地患病动物病料中分离得到的A、C型魏氏梭菌菌株在不同温度、不同培养时间下进行了毒力测定，证明在35℃培养7h时，A、C型魏氏梭菌菌株产毒能力最强。此结果为今后制备A、C型魏氏梭菌疫苗奠定了基础，提供了试验依据。

关键词：A、C型魏氏梭菌；毒力；测定

Abstract: The authors tested the toxicity of Clostridium perfringens strains A and C isolated from diseased animal materials in Shanxi Province at different temperatures and cultivating time.Results proved that when cultivated at 35℃ for 7 h, Clostridium perfringens A and C strains have the strongest production ability. This result laid the foundation for the preparation of Clostridium perfringens A and C vaccines in the future and provided experimental basis.

Key words: Clostridium perfringens strains A and C;toxicity;test

魏氏梭菌（Bacillus welchii）,又叫产气荚膜杆菌（Clostridium perfringens），是1892年英国人Welchii和Nuttad从一具人的腐败尸体产生气泡的血管中最先分离得到，并以Welchii的姓命名 ^[1]。第一次世界大战爆发时，受伤的战士因为感染魏氏梭菌，导致发病率、死亡率都很高。魏氏梭菌引起的疾病占外伤比例达12%，由此引发的伤口感染夺去了15万军人的生命^[2～4]。随着医学进步，血清疗法的出现，现在该菌对人的危害已大大降低。

世界各地对魏氏梭菌引起动物疾病均有报道。该菌广泛分布在自然界，常存在于土壤^[5，6]、饲料、乳汁、粪便、污水以及人和动物肠道中^[7]。Hagan等^[8]指出，土壤是A型魏氏梭菌的自然生活空间。A型魏氏梭菌主要引起兔梭菌性下痢、人畜气性坏疽等，并且它可产生外毒素，主要有α毒素，又称卵磷脂C，它具有增加血管通透性、溶血活性、致死性和血小板凝聚等特性。C型魏氏梭菌则可引起多种动物的猝死症，还可引起仔猪红痢和人的坏死性肠炎，C型菌主要产生的外毒素是α、β外毒素。

魏氏梭菌属厌氧梭状芽孢菌，革兰氏染色阳性，但在陈旧培养物中，往往呈革兰氏阴性。本菌最突出的生化特性就是对石蕊牛乳培养基的“暴烈发酵”，可用于快速诊断。

材料与方法

1 试验材料

1.1 试验动物

山西医科大学试验动物中心购得的体重约16～20g的昆明系普通级小白鼠。

1.2 试验菌株

D6-A，J18-C由本试验前期研究人员从山西省各地患病动物病料中，经细菌的分离纯化、生化试验、病死鹿肠内毒素检查、血清学鉴定得到。

1.3 标准菌株

A型产气荚膜杆菌A31-4，C型魏氏梭菌C59-2，均购自中国兽药监察所。

1.4 试验试剂

北京奥博星生物技术责任有限公司生产的营养琼脂和营养肉汤

血液－葡萄糖－琼脂平板  按文献^[9]配制

石蕊牛乳培养基  按文献^[10，11]配制

革兰氏染色液  按文献^[12]配制

胃蛋白酶（Pepsin 1：3000）

浓盐酸（36%～38%）

肉肝胃酶消化汤  按文献^[9]配制

1.5 其他溶液

生理盐水

1.6 主要仪器和设备

高速冷冻离心机

超净工作台

电热恒温培养箱

厌氧培养箱

光学显微镜

电热恒温水浴箱

电子天平

蒸气消毒锅

2 试验方法

2.1 试验菌株的选育及毒力测定

2.1.1 菌种的复壮

将A、C型魏氏梭菌D6-A株和J18-C株冻存菌种取出，迅速解冻，无菌操作分别接种于厌氧肉肝胃酶消化汤（已在水浴中煮沸10min，排氧）中，37℃恒温培养箱中厌氧培养18～20h（重复一次），此培养液为复壮2代的产物，用于以下镜检观察及毒力测定的试验中。

2.1.2菌株的镜检观察

挑取2.1.1中复壮2代后的培养液，将其接种于5%血液－葡萄糖－琼脂平板培养基上，将恒温培养箱调至37℃，厌氧培养24h，之后将其置于25℃有氧环境中1h，革兰氏染色，镜检，观察记录结果，看是否与A、C型魏氏梭菌标准菌株的菌落特性及革兰氏染色一致。

2.1.3 A、C型魏氏梭菌毒力测定

2.1.3.1 毒素的分离

制备40管厌氧肉肝胃酶消化汤培养基，置于水浴中煮沸10min，将氧气排尽，之后迅速冷却至37℃左右，将2.1.1中复壮2代的菌种D6-A和J18-C按1%量分别接种于40管厌氧肉肝胃酶消化汤培养基内，分别在33℃、35℃、37℃、39℃下分别进行厌氧培养6h、7h、8h、9h、10h后，4℃3000r/min离心20min，吸取上清液即为毒素液，用于小白鼠MLD的测定。

2.1.3.2 各培养条件下小白鼠MLD的测定

将上述分离得到的毒素液作以下处理，A型魏氏梭菌D6-A毒素含量分为0.2ml，0.1ml，0.05ml，0.025ml和0.01ml五个剂量组，C型魏氏梭菌J18-C毒素含量分为0.1ml，0.01ml，0.001ml和0.0001ml四个剂量组，同时设立对照组（注射灭菌生理盐水），每只小白鼠尾静脉注射0.2ml（备注：如果注射剂量不足0.2ml则用明胶缓冲液补足），每组一个重复，观察72h，记录结果。根据死亡情况分别确定A、C型魏氏梭菌对小白鼠的最小致死量（MLD）。

结  果

1毒力测定结果

1.1显微镜观察结果

1.1.1 镜检结果

A、C型魏氏梭菌为革兰氏阳性菌，单个或成双排列，少有链状，菌体粗大正直、两端钝圆。偶尔可在位于菌体中央或近端处见到芽胞，并膨大于菌体。与标准菌株一致。

1.1.2 培养特性和菌落形态

A、C型魏氏梭菌在普通营养琼脂培养基上可生长，但长势不佳。在血液－葡萄糖－琼脂培养基上生长状况良好，呈边缘整齐、表面光滑、隆起的圆形菌落，整个菌落呈灰白色，直径大约1～4mm。因产生外毒素使菌落周围有双溶血环，内环透明，完全溶血；外环不透明，不完全溶血。有氧环境下25℃放置1h后，菌落由灰白色变为灰绿色或草绿色。在厌气肉肝胃酶消化汤中培养后，可见培养管内有大量气体产生，并且伴随有臭味产生，液面布满白色泡沫。

1.2不同温度、不同时间下毒力测定的结果

D6-A株和J18-C株在厌氧肉肝胃酶消化汤培养基中分别于33℃、35℃、37℃、39℃下厌氧培养，各温度分别培养6h、7h、8h、9h、10h后，将毒素分离，测定小白鼠的MLD，结果如下表1～10所示。由表可知在33℃、35℃时，培养6、7h二株产毒能力较强，在35℃培养7h时，二株产毒能力最强。D6-A株对小白鼠的MLD为0.025ml，J18-C株对小白鼠的MLD为0.001ml。

表1 D6－A培养6h产毒活性的测定

表2 D6－A培养7h产毒活性的测定

表3 D6－A培养8h产毒活性的测定

表4 D6－A培养9h产毒活性的测定

表5 D6－A培养10h产毒活性的测定

温度	剂量（ml）					对照	MLD (ml)
	0.2	0.1	0.05	0.025	0.01
33℃	2/2	1/2	0/2	0/2	0/2< 备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《新教师》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复