益气化瘀散结方对胃癌SGC-7901细胞PI3K/AKt/mTOR信号通路的影响
裴俊文
(1郑州大学附属肿瘤医院,河南 郑州 450008;2河南省肿瘤医院,河南 郑州 450008)
【摘要】目的:通过观察益气化瘀散结方干预后胃癌SGC-7901细胞PI3K/AKt/mTOR信号通路分子的表达变化,探讨益气化瘀散结方影响胃癌细胞增殖的作用机制。方法: 体外培养SGC-7901细胞,采用益气化瘀散结方含药血清干预,细胞分为空白血清组及5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清组,药物干预后, MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化,Western-blot、Real-time PCR 技术检测PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表达变化。结果:与空白血清组比较,不同浓度益气化瘀散结方含药血清均能不同程度抑制SGC-7901细胞的增殖,其中10%、20%更为明显(P<0.05),时间上以48h最为明显;与空白血清组比较,10%、20%益气化瘀散结方含药血清组G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低(P<0.05);与空白血清组比较,不同浓度益气化瘀散结方含药血清组PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论:抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路可能是益气化瘀散结方抑制胃癌细胞增殖、调节胃癌细胞生长周期的重要作用机制之一。
【关键词】胃癌;益气化瘀散结方;细胞增殖;细胞周期;PI3K/AKt/mTOR
Effect of Yiqi Huayu Sanjie Decoction on PI3K-AKT-mTOR Signal Pathway of gastric Cancer Cell Line of SGC-7901
Pei Junwen
(1 The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan, 450008;2 Henan Cancer Hospital,Zhengzhou,Henan,450008)
【Abstract】Objective: To observe the expression changes of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway of gastric Cancer Cell Line of SGC-7901,and explore the mechanism of Yiqi Huayu Sanjie decoction on affecting the proliferation of gastric cancer cells. Methods: SGC-7901 cells were cultured in vitro and treated with drug-containing serum of Yiqi Huayu Sanjie decoction, cells were devided into four groups: blank serum group, 5%、10%、20% of drug-containing serum of Yiqi Huayu Sanjie decoction groups, the proliferation rate was detected by MTT, the cell cycle change was detected by flow cytometry, the protein and mRNA expression of PI3K ,AKT and mTOR were detected by Western-blot and Real-time PCR. Results: Compared with the blank serum group, each concentration of Yiqi Huayu Sanjie decoction could inhibit the proliferation of SGC-7901 cells, in which 10% and 20% concentration signisignificant especially(P<0.05), the most obvious time was 48 h;Compared with the blank serum group, the proportion of cells in the G0/G1 phase increased and S phase decreased significantly in 10% and 20% concentration of Yiqi Huayu Sanjie decoction group(P<0.05); Compared with the blank serum group, the expression of PI3K,AKT,mTOR protein and mRNA in serum of different concentration of Yiqi Huayu Sanjie decoction were significantly decreased (P<0.05).Conclusion: Inhibition of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway may be one of the important mechanisms of Yiqi Huayu Sanjie decoction on inhibiting the proliferation and regulating the growth cycle of gastric cancer cells.
【Key words】Gastric Cancer; Yiqi Huayu Sanjie Decoction; Proliferation; Cell Cycle; PI3K/AKt/mTOR
胃癌(GC)是世界上第四大最常见的癌症,也是全球第二大癌症相关死亡原因[1]。根治术后早期胃癌预后良好,而由于早期临床症状不明显,大多数胃癌被诊断时已为晚期,导致5年生存率极低,在西方发达国家,胃癌的5年生存率低至10-19%[2-3]。我国胃癌的发病率和死亡率在各种恶性肿瘤中均居首位,每年新发病例约40 万例,占世界总发病例数的42%,因此,胃癌的治疗极具挑战性[4-5]。研究表明,PI3K / AKT / m TOR信号通路在介导胃癌细胞生长、增殖、代谢、生存和血管生成中起着至关重要的作用[3,5,6]。中医药在改善胃癌等肿瘤患者临床症状、提高生活质量、实现带瘤生存以及改善化疗毒副作用等方面的作用已逐渐得到公认。本研究通过体外实验观察我科治疗胃癌的有效验方益气化瘀散结方对胃癌细胞株SGC-7901的影响,并通过PI3K/AKt/mTOR信号通路分子的变化探讨益气化瘀散结方调控胃癌细胞增殖及生长周期的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料 人胃癌细胞株SGC-7901由河南中医药大学第一附属医院实验室惠赠。益气化瘀散结方由党参15 g、白术10 g、黄芪 30 g、当归 15 g、川芎 15 g、桃仁12 g、红花12 g、夏枯草15 g、土鳖虫9 g、炙甘草9 g组成。RPMI-1640 细胞培养基、胎牛血清,Hyclone 公司;噻唑兰( MTT )、二甲基亚砜( DMSO),胰蛋白酶,Solarbio公司;PI3K、AKT、mTOR单克隆抗体,CST公司;β-actin一抗、牛抗鼠二抗,Santa Cruz公司;RNA提取试剂盒,TIANGEN公司;反转录试剂盒,Vazyme公司;SYBR® Green I荧光定量PCR试剂盒,Qiagen公司;细胞周期检测试剂盒,BD公司。
1.2 细胞培养 SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中,置于37 ℃、5% CO2的CO2 孵箱中培养。
1.3 益气化瘀散结方含药血清制备 SPF级健康雄性SD大鼠20只,体质量(230±20)g,体重180~220g,按体质量随机分为益气化瘀散结方组和空白对照组,各10只。益气化瘀散结方给药剂量按照成人临床等效剂量换算灌胃,空白对照组灌胃等量蒸馏水。2次/d,连续4 d。最后1次灌胃1 h后用水合氯醛麻醉,采用无抗凝剂真空采血管从腹主动脉取血。室温静置2 h,3500 rpm 离心20 min,同组分离的血清一块混匀,经恒温水浴56℃灭活30 min,在超净台用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后,分装,放入-80℃冰箱中保存备用。
1.4 不同浓度益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞活性和增殖的影响 SGC-7901细胞生长至对数生长期,消化,种至96孔板,分为5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清组(实验组)和空白对照组,空白对照孔采用空白鼠血清。分别培养一定时间(12 h、24 h、48 h、72 h)后,MTT法检测细胞增殖率。
1.5 流式细胞术检测各组细胞周期 胰酶消化细胞后,用冷PBS洗细胞两次,每次300g×5min;弃上清留大约50ul液体以防止碰到细胞团,加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞,300g×5min离心,洗涤2~3次;最后一次洗完后,加入1ml Buffer Solution重悬细胞,计数,用Buffer Solution调整细胞密度为1×106个/ml;取0.5ml含细胞5×105个,每管加Solution A 250ul,用手轻拍混匀(勿用漩涡混匀);室温放置10min,保留Solution A,再加Solution B 200ul,轻轻混匀,室温孵育10min,保留Solution A+B;加预冷Solution C 200ul,轻轻混匀,2-8℃避光孵育10min;最后用50um尼龙网过滤细胞,上流式细胞仪分析。
1.6 Western-blot 技术检测各组细胞PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达 消化收集各组细胞,PBS 1000转5分钟离心,洗涤细胞2次,用RIPA裂解液(按1%的比例加PMSF)裂解细胞,10000g离心10分钟提取细胞总蛋白。按照BCA法进行蛋白定量,将各蛋白样品调整至一致浓度。根据实验取适量蛋白样品,按照4:1的比例加入5×SDS上样缓冲液,混匀后95 ℃加热3~5 min,使蛋白变性。将变性的蛋白加入制好的SDS凝胶孔中,采用恒压法进行电泳,浓缩胶100 V、分离胶80 V。电泳结束后,取出凝胶,确定目的条带的大致位置后,将多余的凝胶切除,裁取比目的凝胶稍大的PVDF膜,甲醇中浸泡5min,然后按照胶、滤纸、膜的顺序,其中胶在负极(黑的一面),于4℃环境下200 mA恒流转膜2 h。转膜完后取出PVDF膜,于5% 脱脂奶粉中,摇床封闭1~2 h。用封闭液稀释抗体(PI3K、AKT、mTOR、β-actin,稀释比例参考抗体说明书),膜在抗体中4 ℃孵育过夜。弃一抗, TBST洗膜3次,每次5 min,然后加入稀释后的二抗于室温下孵育1 h。TBST洗膜3次,每次5 min,加ECL发光液,室温孵育3~5 min,用Western Blot 扫膜仪采集膜上的蛋白条带,并分析计算各条带的灰度值。
1.7 Real time PCR技术检测细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达 根据 Gen Bank 靶基因序列设计引物,以 GAPDH 为内参,均由上海生工生物工程技术有限公司合成。GAPDH序列:上游TCGGAGTCAACGGATTTGGT,下游TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC,产物181bp。PI3K序列:上游AGATCGCTCTGGCCTCATTG,下游TCCAGGTCATCCCCAGAGTT,产物150bp。AKT 序列:上游AGCCTGGGTCAAAGAAGTCA,下游TACTCCCCTCGTTTGTGCAG,产物195 bp。mTOR 序列:上游AAGCCGCGCGAACCTC,下游CTGGTTTCCTCATTCCGGCT,产物134 bp。消化收集各组细胞,提取总 RNA,反转录,然后采用SYBR-Green 荧光定量试剂盒,罗氏 480 实时荧光定量 PCR仪检测各组细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表达,采用 2-△△Ct法进行数据分析。
1.8数据统计 采用SPSS 17.0软件统计分析实验所得数据。计量资料以(±s)表示,组间比较采用t检验;计数资料用百分率表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学差异。
2结果
2.1益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的抑制作用比较 见表1。与空白对照组比较,5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能不同程度的抑制SGC-7901的增殖,其中以10%、20%含药血清抑制作用明显(P<0.05);在时间上,随着时间延长,益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的抑制作用逐渐增强,48h达到高峰,至72h已经下降。因此本研究后续实验以48h为各浓度益气化瘀散结方含药血清干预时间。
表1 不同浓度益气化瘀散结方含药血清对SGC-7901细胞增殖的抑制率比较(%,±s)
组别 |
12 h |
24 h |
48 h |
72 h |
5%含药血清组 |
3.34±0.46 |
5.40±1.21 |
11.94±2.26 |
13.63±2.78 |
10%含药血清组 |
4.15±0.72 |
9.48±1.38△ |
19.47±3.51△ |
17.81±2.66△ |
20%含药血清组 |
4.27±0.68 |
10.53±2.37△ |
18.84±3.77△ |
15.78±3.49 |
与5%含药血清组比较,△P<0.05
2.2益气化瘀散结方对SGC-7901细胞周期的影响 见表2。用流式细胞术检测各组细胞的周期分布情况,结果显示,与空白血清组和5%含药血清组比较,10%、20%益气化瘀散结方含药血清组G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低(P<0.05)。
表2益气化瘀散结方对SGC-7901细胞周期的影响(%,±s)
组别 |
n |
G0/G1期(%) |
S期(%) |
G2期(%) |
空白血清组 |
6 |
48.51±12.47 |
46.56±13.64 |
4.87±1.56 |
5%含药血清组 |
6 |
56.77±15.58 |
38.45±8.70 |
4.73±1.28 |
10%含药血清组 |
6 |
74.36±17.84△▲ |
20.44±5.63△▲ |
5.33±1.79 |
20%含药血清组 |
6 |
75.82±18.95△▲ |
21.65±6.18△▲ |
3.24±1.22△▲ |
注:与空白血清组比较,△P<0.05;与5%含药血清组比较,▲P<0.05
2.3益气化瘀散结方对SGC-7901细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表达的影响 利用β-actin作为内参计算PI3K、AKT、mTOR蛋白在各组细胞中的相对表达量。结果显示,与空白血清组比较,5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能下调PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达(P<0.05);不同浓度益气化瘀散结方含药血清组间比较,5%含药血清组PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达量高于10%、20%含药血清组(P<0.05)。见表3、图1。
表3各组细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白表达比较(±s)
组别 |
PI3K相对表达量 |
AKT相对表达量 |
mTOR相对表达量 |
空白血清组 |
1.48±0.37 |
1.83±0.69 |
1.44±041 |
5%含药血清组 |
1.15±0.33△ |
1.18±0.45△ |
1.07±0.52△ |
10%含药血清组 |
0.84±0.34△▲ |
0.71±0.22△▲ |
0.63±0.23△▲ |
20%含药血清组 |
0.87±0.28△▲ |
0.94±0.35△▲ |
0.52±0.16△▲ |
注:与空白血清组比较,△P<0.05;与5%含药血清组比较,▲P<0.05
图1 各组细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白免疫印迹条带图
注:1、空白血清组;2、5%含药血清组;3、10%含药血清组;4、20%含药血清组
2.4 益气化瘀散结方对SGC-7901细胞PI3K、AKT 、mTOR mRNA表达的影响 以GAPDH作为内参基因,采用2-△△Ct法分析比较各组细胞目的基因变化。结果显示,与空白血清组比较,5%、10%、20%益气化瘀散结方含药血清均能下调PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达;不同浓度益气化瘀散结方含药血清组间比较,5%含药血清组PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量高于10%、20%含药血清组见表4。
表4各组细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表达(±s)
组别 |
PI3K |
AKT |
mTOR |
||||||
△Ct值 |
2-△△Ct |
△Ct值 |
2-△△Ct |
△Ct值 |
2-△△Ct |
||||
空白血清组 |
3.89±1.82 |
|
2.83±1.82 |
|
4.43±2.49 |
|
|||
5%含药血清组 |
5.48±1.29 |
0.33△ |
4.56±1.29 |
0.30△ |
5.48±1.38 |
0.48△ |
|||
10%含药血清组 |
6.83±1.12 |
0.13△ 0.39▲ |
7.35±1.12 |
0.04△ 0.14▲ |
8.47±2.83 |
0.06△ 0.13▲ |
|||
20%含药血清组 |
6.77±1.38 |
0.14△ 0.41▲ |
6.89±1.38 |
0.06△ 0.20▲ |
8.66±2.79 |
0.05△ 0.11▲ |
注:与空白血清组比较,△基因表达明显降低(2-△△Ct≤0.5);与5%含药血清组比较,▲基因表达明显降低(2-△△Ct≤0.5)
3 讨论