持续静脉泵注利多卡因对脓毒症大鼠肺组织HMGB1 mRNA基因表达的影响

徐桂萍 李青青 张宇轩

830000乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院麻醉科（徐桂萍、张宇轩）；830011乌鲁木齐，新疆医科大学研究生院（李青青）

【摘要】目的  探讨不同时期持续静脉输注利多卡因对脓毒症大鼠肺组织中HMGBlmRNA基因表达的影响及机制。方法  健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按随机数字表法分成5组（每组15只）：假手术组（sham,S组）、盲肠结扎穿孔组(cecal ligation and puncture,CLP组)、CLP前输注利多卡因组(L1组)、CLP即刻输注利多卡因组(L2组)以及CLP后输注利多卡因处理组(L3组)。S组打开腹腔后缝合，其他各组采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症模型，L1、L2和L3组分别在CLP前、CLP开始时以及CLP完成后三个时间段持续输注利多卡因，S组和CLP组用等量生理盐水代替。于CLP后24小时处死大鼠，ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α以及高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)浓度。qRT-PCR法检测肺组织组织中HMGB1mRNA的表达量。结果  与S组比较，CLP组、L1、L2、L3组均发生脓毒症，且血清IL-6、TNF-α、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGBl)浓度和肺组织中HMGB1mRNA表达量均增高（ P< 0.05 ）。L1、L2、L3组血清中HMGB1、IL-6、TNF-α以及肺组织中HMGB1 mRNA较CLP组均明显降低（P< 0.05）。结论  脓毒症可以使大鼠促炎因子表达增强，持续静脉泵注利多卡因可以有效降低脓毒症大鼠炎症因子IL-6、TNF-α，HMGB1的表达，抑制肺组织中HMGB1 mRNA基因表达量，减轻脓毒症对肺脏的损伤，有效提高动物存活率。

【关键词】利多卡因，脓毒症，持续输注，HMGB1（高迁移率族蛋白B1）

The effect of continuous infusion of lidocaine on HMGB1 mRNA expression in lung tissue in CLP rats

Xu Guiping ，Li Qingqing， Zhang Yuxuan

Department of Anesthesiology,People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region ,Urumqi 830000 ,China (Xu GP);  Graduate School ,Xinjiang Medical University ,Urumqi 830011 ,China(Li QQ);Department of Anesthesiology,People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region ,Urumqi 830000 ,China （Zhang YX）

Corresponding author: Xu Guiping, Email：xgpsyl@126.com

【Abstract】 Objective  To evaluate the effect and mechanism of intravenous infusion of lidocaine on the expression of HMGB1 mRNA in lung of CLP rats.Methods  Healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were stochastically divided into 5 groups (15 rats for each group) respectively including: S group (group S), cecal ligation and puncture group (group CLP),pre-CLP infusion The lidocaine group (group L1), CLP were immediately infused with lidocaine (group L2), and CLP were infused with the lidocaine-treated group( group L3). S group suture abdominal cavity after opening it and the other groups were ligated with cecal ligation and puncture. L1, L2, and L3 groups were infused with lidocaine for 3 hours before CLP, when CLP started, and after CLP was completed. The S group and the CLP group were replaced by the same amount of normal saline. The rats were sacrificed 24 hours after the CLP model was successfully established. The serum levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 , TNF-α and high mobility group box 1 (HMGB1) concentration were measured by ELISA.The expression of HMGB1 mRNA in lung tissue was detected by qRT-PCR. Results  Compared with S group, CLP occurred in the CLP , L1, L2, and L3 groups, and IL-6, TNF-α, high mobility group box 1 (HMGB1) concentrations, The expression of HMGB1 mRNA was increased in renal tissue and lung tissues . (P < 0.05). The serum levels of HMGB1, IL-6, TNF-α and HMGB1 in the L1, L2, and L3 groups were significantly lower than those in the CLP group (P<0.05).Conclusion  CLP can increase the expression of pro-inflammatory cytokines in rats. Lidocaine can inhibit this change. Intravenous infusion of lidocaine can effectively reduce the expression of inflammatory factors in CLP rats and inhibit the expression of HMGB1 mRNA in lung tissues. It reduces the organ damage caused by CLP and improves the survival rate effectively.

【Key words】 Lidocaine, CLP,continuous infusion, HMGB1 (high mobility group box B1)

根据最新的sepsis 3.0脓毒症包括感染性休克，是由于机体对感染的反应失调所致的危及生命的器官功能衰竭,不仅指循环衰竭，且强调细胞代谢异常从而导致高死亡风险^【1】虽然抗菌药物的使用、液体复苏以及生命支持的发展,脓毒症的治疗水平已较过去有了明显的提高,但其病死率仍居高不下^【2】。我们最熟悉的局部麻醉药利多卡因不仅可以用于麻醉和抗心律失常，还可作用于炎症反应的多个方面，发挥重要调节作用^【3】，其抗炎机制可能与晚期炎症因子HMGB1有关，HMGB1是一种无处不在的核蛋白，介导了先天免疫反应的激活，在宿主炎症反应中发挥关键作用^【4】。本次研究我们以雄性SD大鼠为研究对象，使用盲肠结扎穿孔（CLP）的方法制作脓毒症动物模型，考虑到在重症监护室的脓毒症病人的特殊性，其感染重且一般都在脓毒症晚期，所以我们选择不同时机的干预对指导临床治疗有着重要意义。具体以10mg•kg^-1•h^-1的输注速度在CLP前、CLP发生时以及CLP完成后三个时间段持续输注利多卡因3小时，观察不同时期输注利多卡因对脓毒症大鼠肺组织内HMGBl基因表达的影响，进一步探讨利多卡因抗炎/抗脓毒症的机制。

1.材料与方法

1.1实验试剂及仪器

2%盐酸利多卡因（1170120104 河北天成药业股份有限公司），微量注射泵（史密斯WZS-50CG 浙江大学医学仪器有限公司）注射精度±2%，Trizol（252250AX  Aidlab），HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)（R101-01/02  VAZYME），大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)酶联免疫吸附测定试剂盒（E-EL-R0505c Elabscience），大鼠白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒（E-EL-R0015c Elabscience），大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒（E-EL-R0019c Elabscience），PCR仪（EDC-810 东胜创新生物科技有限公司），微型高速离心机（C2500-R-230V Labnet）。

1.2实验方法

1.2.1动物选择与分组：雄性成年SD大鼠（购自新疆医科大学动物实验中心）125只，体重250-300g。动物使用许可证编号：SCXK（新）2016-0002。大鼠饲养在通道良好，光线充足的动物房内。室内温度控制在20-26℃，湿度40%-60%，自由饮食饮水，由专业饲养人员喂养。实验前12小时禁食水，75只雄性SD大鼠采用随机数字表法分成5组（每组15只）：S组、CLP组、L1组、L2组以及L3组。S组打开腹腔后缝合，其他各组采用盲肠结扎穿孔术制备模型，L1、L2和L3组分别在CLP前、CLP开始时以及CLP完成后三个时间段以10mg•kg^-1•h^-1的速度持续输注利多卡因3小时（根据利多卡因半衰期及HMGB1的达峰时间综合考虑），S组和CLP组用等量生理盐水代替。

1.2.2动物模型的制备

根据参考文献^【5】制备脓毒症模型。动物以2%戊巴比妥钠（80mg/kg）麻醉后，将其固定在鼠板上。备皮消毒后，下腹正中做约2cm的纵切口，打开腹膜，将位于左下腹的盲肠牵出腹腔，平展于腹壁表面，显示解剖结构，用平镊将肠内容物向盲肠内缓慢轻柔挤压，结扎回盲瓣至盲肠游离端外2/3。用18Ｇ针头穿透结扎远端盲肠１次，并用平镊挤出少量肠内容物，确认两孔眼通畅，将盲肠还纳逐层缝合腹切口，术中监测大鼠生命体征稳定未出现缺氧等干扰实验结果的不利因素。随后大鼠嗜睡、竖毛、饮水减少、眼角出现黑色分泌物，随着时间的延长甚至出现死亡，模型组大鼠血浆谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），肌酐（Cr）以及组织病理切片出现典型炎性改变和损伤，表明脓毒症模型复制成功。

1.2.3利多卡因持续输注

L1、L2、L3组大鼠在相应的时间尾静脉消毒后置入24号套管针连接延长管与微量泵相通以10mg•kg^-1•h^-1的速度持续输注利多卡因3小时，S组和CLP组用等量生理盐水代替。

1.3标本采集

于24小时后过量麻醉处死大鼠，打开腹腔下腔静脉采5ml静脉血，3500r/min4℃离心10分钟后，留取上清液-20℃冰箱保存待测。快速留取肺组织、肾组织DEPC水冲洗后保存于-80℃冰箱中待测。快速留取肺、肾脏组织于4%多聚甲醛中固定24小时以上，定期更换保存液。

1.4指标测定

1.4.1 HMGB1、IL-6、TNF-α的测定

将离心后冻存的血清通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定HMGB1、IL-6、TNF-α炎性指标。

1.4.2肺组织HMGB1mRNA测定

采用实时荧光定量PCR检测mRNA。分别取-80℃冰箱中保存的新鲜冰冻肺组织和肾组织，重量约为100mg，加入1ml Trizol试剂，用匀浆器研磨成浆，移至无RNase的1.5ml EP管中，裂解10min，RNA经过分离、沉淀洗涤、溶解提取出总RNA，逆转录试剂盒反转录成cDNA，然后进行PCR扩增，HMGB1基因序列上游引物5’-AGTTCAAGGACCCCAATGCC-3’，下游引物5’- TTGTCATCCGCAGCAGTGTT-3’，产物160bpGAPDH上游引物5’- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，下游引物5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，产物253bp。实时荧光定量PCR检测HMGB1mRNA。反应体系配制完成后轻微离心，转至PCR反应用毛细管中，离心后放入Light Cycler中进行PCR反应，观察扩增曲线与溶解曲线，将同一DNA模板的目的基因与内参配对后观察分析数据。

1.4.3 生化参数检测

全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功能（ALT、AST），肾功能（Cr）。

1.4.4病理学观察

取4%多聚甲醛中固定的肺组织切成2-3mm厚度的组织片，脱水后石蜡包埋切成5µm薄片，进行HE染色后光镜下观察并采集图像。

1.4.5生存率

另取50只大鼠分组与实验方法同上，统计72小时存活率，S组大鼠10只均存活，（存活率100%），CLP组大鼠1只存活（10%），L1组7只存活（70%），L2组6只存活（60%），L3 组7只存活（70%）。

1.5统计学分析

     所有数据采用双人录入，并进行数据一致性检验。输入SPSS22.0统计软件包进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（_± s）表示，组间比较方差齐采用完全随机设计的方差分析；两两比较再进行两两比较方差不齐采用秩和检验，两两比较方差不齐采用t’检验。采用非正态分布的计量资料以中位数（25百分位数，75百分位数）[M(P25,P75)]形式表示，两组间比较采用秩和检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 与S组比较，CLP组、L1、L2和L3组血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平明显升高（p<0.05）；与CLP组比较，L1、L2和L3组血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平降低（p<0.05表1），利多卡因处理组进行两两比较得出结论以L3降低最显著。

表1   5组大鼠血清中IL-6 、TNF-α 、HMGB1的比较（_± s）

注：与S组比较，^aP<0.05,与CLP组比较。^bP<0.05 S组:假手术组；CLP组：盲肠结扎穿孔组；L1组:CLP前输注利多卡因组；L2组:CLP即刻输注利多卡因组；L3组:CLP后输注利多卡因处理组。IL-6:白介素6 ；TNF-α：肿瘤坏死因子α；HMGB1：高迁移率族蛋白B1

2.2 与S组比较，CLP组、L1、L2、L3组肺组织中HMGB1 mRNA表达明显增高（p<0.05）；与CLP组比较，L1、L2、L3组肺组织中HMGB1 mRNA表达明显降低（p<0.05表2），两两比较以L3降低最显著。

表2 5组大鼠肺组织、肾组织HMGB1 mRNA表达量的比较（_± s）

注：与S组比较，^aP<0.05,与CLP组比较。^bP<0.05  S组:假手术组；CLP组：盲肠结扎穿孔组；L1组:CLP前输注利多卡因组；L2组:CLP即刻输注利多卡因组；L3组:CLP后输注利多卡因处理组。

2.3 与S组比较，CLP组、L1组L2组和L3组ALT、AST、Cr均有升高，差异有统计学意义（p<0.05表3）与CLP组比较，L1、L2、L3组ALT、AST、Cr均有降低（p<0.05）。

表3   5组大鼠血清中ALT、AST、Cr的比较（_± s）

注：与S组比较，^aP<0.05,与CLP组比较。^bP<0.05 。S组:假手术组；CLP组：盲肠结扎穿孔组；L1组:CLP前输注利多卡因组；L2组:CLP即刻输注利多卡因组；L3组:CLP后输注利多卡因处理组。

ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；Cr：肌酐

3.讨论  

本实验采用盲肠结扎穿孔术制造大鼠脓毒症模型，该方案接近临床脓毒症患者生理状态，与人类临床疾病存在较多共性，更适合模拟人类脓毒症状态。研究持续静脉泵注利多卡因对脓毒症大鼠抗炎作用，研究最佳给药时机以及证实10mg·kg-1·h-1的剂量是否安全有效，进一步探索持续静脉泵注利多卡因抗炎/抗脓毒症的机制。 经过实验证实静脉泵注利多卡因可以有效降低血清中炎症因子及HMGB1的浓度，并且可以抑制肺组织中HMGB1 mRNA基因表达。在王焕亮等人的研究^【6-7】中也有类似的发现，与国内学者研究不同的是，第一，本次研究采用持续尾静脉输注利多卡因的技术使得利多卡因在大鼠体内更好更准确的发挥药物作用，始终维持一个恒定的血药浓度，最大程度的覆盖脓毒症发作的时间窗，达到抑制炎症反应的目的。第二，在不同时机输注利多卡因并检测血清炎症因子的表达量探索一个最佳给药时机。为控制变量，采取单一剂量不同时间给药，根据实验动物学大鼠与人类药物剂量转换折算系数W=6.25，计算得出大鼠利多卡因的用药剂量在6.25-13mg/kg，取平均数约10mg/kg。造模的不同的时间段持续的以同一剂量输注利多卡因，发现在CLP后持续输注利多卡因炎症因子水平以及HMGB1均降低，大胆猜测可能是由于在此治疗时间窗内利多卡因的输注抑制了NF-кB从而使HMGB1表达减少，CLP术后这个时间段包括了脓毒症前，脓毒症早期，脓毒症晚期相当于“围脓毒症期”，在此时间窗内持续输注利多卡因不仅可以防止脓毒症休克的发生而且有效降低了炎症因子的释放，减轻炎症反应与组织损伤。实验中我们发现持续输注利多卡因的大鼠术后神志很快清醒，较CLP组更活跃。关于利多卡因抗脓毒的机制一直以来备受争议，大多研究还是倾向于利多卡因通过抑制HMGB1/TLR4/NF-кB通路发挥抗炎作用。其中Toll样受体4（TLR4）是激活先天免疫和细胞因子释放的关键受体，是HMGB1依赖性激活过程所必需的。外源性的病原体衍生分子，在无入侵的情况下，通过缺血或细胞损伤被动释放，建立HMGB1结合的分子机制，通过TLR4有效逆转先天免疫的激活，并显著减弱炎症损害^【8】。HMGB1与体外培养大鼠肾小管上皮细胞上的TLR4的相互作用介导了肾小管上皮细胞炎性反应，主动合成并释放炎性因子^【9】。NF-кB是炎症通路的关键因子，在LPS（脂多糖）诱导的脓毒症模型中，内毒素通过TLR4活化NF-кB机制复杂，不是直接活化，很可能有其他信号途径或机制参与其中^【10】。除此之外，与HMGB1同一个家族的HMGN1被发现不仅直接刺激细胞因子的产生，而且还具有通过TLR4依赖性途径诱导免疫耐受的能力，与脂多糖（LPS）诱导的耐受性相似^【11】。也有报道认为重要的免疫调控因子微小 RNAs(miRNAs)，可通过TLRs／NF-кB信号通路参与固有免疫调控，在脓毒症发病过程中发挥重要作用^【12】。利多卡因是如何改善炎症反应，如何减少HMGB1等炎症因子的释放的？同为TLRs家族的TLR9可以抑制NF-KB的表达，利多卡因抑制NF-KB表达，因此利多卡因和TLR9之间又存在何种联系呢？值得我们进一步深入研究，本次研究的不足之处没有对利多卡因的血药浓度进行实时监测。本研究应用利多卡因旨在预防脓毒症发病的程度，有脓毒症风险的病人可以预防性的输注利多卡因，降低其发病风险从而降低死亡率，但是针对脓毒症的治疗利多卡因的单一应用不足以攻克脓毒症，治疗还需联合应用其他药物。

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