胸腺癌基因改变对疾病诊断及精准治疗的指导意义

张宏毅¹     朱晓磊²     王辉林²

 

Abstract:

Background: thymoma is a multiple in the anterior mediastinum, by thymic epithelial differentiation and tumor. Due to the low incidence of the disease, a large number of clinical trials and studies have been hindered. The current progress in the field of thymoma is slow, mainly still rely on surgery treatment. With the progress of the two generation sequencing technology and molecular biology, we have a certain understanding of the molecular characteristics of thymoma. In order to explore the tumor occurrence and progression, prognosis and malignant degree of related gene mutations, we through the two generation sequencing of the gene analysis of thymoma.

Methods: collected from 2011-2015 and surgical treatment of our department, the final pathological diagnosis of thymoma (A, AB, B1, B2, B3, C) with a total of 24 cases. We use TM V2.0 [LK103] Langkang burning stone detection project by Kang line panel.56 in normal tissues and tumor tissues of 56 tumor related genes were analyzed, the analysis results of WHO and pathological type, Masaoka staging and survival were compared.

Results: the total 24 patients, 9 cases were not detected mutations, mutations in 15 patients, 7 cases of thymoma, thymic carcinoma in 8 cases, from samples of patients with thymoma mutation rate was 53%, the mutation rate was 73% in patients with thymic carcinoma. Only 4 of the 15 patients had a single gene mutation. Mutant gene contains PDGFR, EGFR, ROS1, IGF1R 4 tyrosine kinase genes, which are not detected KIT gene mutation from the table. We detected some frequent mutations, the mutation rate of the highest breast cancer gene is TP53, thymoma in the highest mutation rate because of BRCA1. In the frequent mutation detection rate was significantly higher than that of thymoma TP53 thymic carcinoma of the mutant gene, and the cell cycle protein CDKN2A gene only in thymic carcinoma mutations. The two generation sequencing results suggest that gene mutation quantity, TP53 and cell cycle protein gene mutation may have a certain predictability in the extent of malignant thymoma.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

摘要：

背景：胸腺瘤是一种多发于前纵膈，由胸腺上皮分化而来的肿瘤。由于此种疾病的低发生率阻碍了大量临床试验及研究的开展。目前胸腺瘤领域的进展缓慢，主要治疗依然依靠手术切除。随着二代测序技术的出现及分子生物学领域的进展，我们对胸腺瘤分子学特征有了一定的认识。为了探索与肿瘤发生、进展、预后、恶性程度相关的突变基因，我们通过二代测序对胸腺瘤进行基因分析。

方法：收集自2011-2015年与我们科行手术治疗，最终病理确诊为胸腺瘤（A、AB、B1、B2、B3、C）的患者共24例。我们选用燃石朗康TM V2.0 [LK103]检测项目通过康系panel.56对正常组织与肿瘤组织56个肿瘤相关基因进行分析，将分析结果与WHO病理分型、Masaoka分期、患者生存期进行比较。

结果：送检24例患者中，9例患者未检测到基因突变，存在突变的15例患者中胸腺瘤7例、胸腺癌8例，送检样本中胸腺瘤患者突变率为53%，胸腺癌患者突变率为73%。15例患者中仅有4例患者为单一基因突变。突变基因中包含PDGFR, EGFR，ROS1, IGF1R 4种络氨酸激酶基因，其中未检测到KIT基因突变.送检的表本中我们检测到了部分频发突变基因，胸腺癌中突变率最高的基因为TP53，胸腺瘤中突变率最高的基因为BRCA1。在频发突变基因中检测到胸腺癌中TP53突变率明显高于胸腺瘤，且细胞周期蛋白基因CDKN2A仅在胸腺癌中出现突变。二代测序检测结果提示我们基因突变数量、TP53及细胞周期蛋白基因突变可能在胸腺瘤恶性程度上具有一定的预测性。

 

 

一．介绍

胸腺瘤是一种罕见的胸腺上皮来源的肿瘤，胸腺瘤根据组织学特点可以分为A、AB B1/B2/B3、c型。胸腺癌根据他的组织学特性分为很多种。组织学上的多种差异加上胸腺癌的低发生率阻碍了对这种肿瘤大规模的研究，使得我们对这种疾病生物学行为、流行病学以及相应的治疗等方面研究非常有限。目前除了手术切除并没有其他更为有效的治疗方法术后复发患者的预后很差^[1-5]为了更有效的治疗胸腺癌，已有很多关于胸腺癌发生的分子学通路的研究，但是仅发现了部分重复频率较低的基因包括EGFR^[6-8]、HER2^[9、10]、KIT^[7、8、11]、Kras^[8、12]以及P53^[13、14]。

目前，为了适应更精准的靶向治疗趋势，二代测序（NGS）技术不断发展，NGS能够检测肿瘤全基因组或特定序列的基因突变情况。使用这种方法能够更高效更精确的分析胸腺瘤发生及进展的分子学机制，为胸腺瘤预后的预测及治疗方法的选择提供指导。本研究中，为了明确胸腺瘤形成相关基因突变，我们选用燃石朗康TM V2.0 [LK103]检测项目通过康系panel.56对正常组织与肿瘤组织56个肿瘤相关基因进行分析，将分析结果与WHO病理分型、Masaoka分期、患者生存期进行比较。

 

二．材料与方法

2.1  患者选择

这项研究包括24个胸腺瘤患者，这些患者是2011-2015年在我们科行手术治疗的患者。患者的信息在表一中详细介绍。这些患者年龄区间在51岁-63岁之间，平均年龄在56岁。24名患者中男性患者有19名，女性患者有5名。病理类型包括A、AB、B1/B2/B3、C，本研究中将患者分为胸腺癌组（12人）和非胸腺癌组胸（12人）腺瘤的诊断需要一些特殊的免疫组化指标，其中包括CD5，c-kit 、Bcl-2，我们使用2004年的胸腺瘤WHO组织学TNM分期（World Health Organization classification oftumors. Pathology and genetics. International Agency for Researchon Cancer Press, 2004, 146–151），临床分期使用Masaoka分级。24名患者的正常胸腺组织均可以进行分析。入组前已获得患者书面同意。

 

2.2  DNA准备及二代测序技术

24名患者的DNA均取自手术切除后肿瘤组织及正常组织石蜡包埋标本，标本进行二代测序前首先进行标本质量检测，24 名患者标本质量均合格。二代测序技术采用燃石公司燃石朗康TM V2.0 [LK103]检测项目，使用康系panel.56对56个肿瘤相关基因进行检测，检测结果审核合格后回报。

 

Table 1. Clinicopathological Characteristics of StudyPopulation

Thymic  Carcinoma Thymoma

Sex  Male                   9                        10  Female                 3                         2 Age  Median                49                        51  Range                 39-59                    39-63 Stage (Masaoka)  I+II                    2                           7  III+IV                  10                          5 Postoperative： chemotherapy           9                           4 ·  Gemcitabine+Cisplatin    6                           3 Pemetrexed+Cisplatin    3                           1 Radiotherapy            7                          3   Neoadjuvant            2                          0                             R&C  ：radiotherapy and chemotherapy

 

结果：共送检24个样本，检测前进行样本质量检测，质控由二代测序公司施行，所有样本均通过质量检测。送检的24例样本中，胸腺瘤12例，其中，WHO分型A 型3例，B型7例，B型中B3型4例，AB型2例。胸腺癌共12例，其中胸腺鳞癌7例。我们共检测了56热点突变基因。送检的24例样本中有15例检测到突变，在12例胸腺癌患者中有9例存在突变。在9例胸患者中仅有两例患者为单基因突变，分别为NOTCH1和NTRK1突变。在胸腺癌中突变频率最高的基因是TP53（N=3），均为非同义突变，其中两例是missense _Variant，另外一例是stop_gain Variant，其中一例同时包含有EGFR突变。3例胸腺癌患者Masaoka临床分期一例为III期，另外两例为IV期并在术后接受放疗和化疗，目前病情稳定。有相关研究对15例胸腺癌进行二代基因测序，结果提示15例中有4例存在TP53突变，4例TP53突变的患者Masaoka分期均为III-IV期，有两例患者已经死亡，平均存活时间为2.2年。对比之下，；另外11例不存在TP53突变的胸腺癌患者中仅有一例因为非肿瘤相关原因死亡，其他患者都存活。在11例患者中，除4例患者分期在IV期，其余胸腺瘤Masaoka分期均在I-III期。该研究认为TP53可能与疾病的恶性程度及不良预后相关，TP53基因突变和P53蛋白的表达有密切的联系，存在TP53突变的患者，60%的肿瘤细胞核中过度表达P53，而TP53阴性的患者仅有散在表达^[15]。本研究中胸腺癌第二高频突变基因是肿瘤抑制基因CDKN2A，在9例胸腺癌患者中有2例出现CDKN2A突变，其中一例同时包含TP53突变，另外一例同时包含FGFR3基因突变。MTOR基因突变与CDKN2A出现频率一致，9例胸腺癌患者中有两例出现突变。其中一例同时包含TP53基因突变及CDKN2A基因突变，另外一例同时含有PDGFRA突变和PTCH1突变。除此之外我们还检测到EGFR、IGF1R、IDH2、ROS1、CDK4等基因突变，均未重复出现。

本研究送检胸腺瘤共12例（A=3、B1/B2=4、B3=3 、AB=2），12例胸腺瘤患者中有6例不存在突变其中AB型2例、A型1例、B1型2例、B3型一例。3例患者仅存在单基因突变分别是A型一例，突变基因为PTCH1，B1型一例，突变基因为APC，B3型一例，突变基因为APC基因。送检胸腺瘤患者样本中突变频率最高为BRCA1（N=3），其次是APC突变（N=2），除此之外还检测到MTOR、NTRK3、NF1、HRAS、RET、BRAF、AKT1、MAP2K1、ALK、TSC1、FLT3、PTEN等基因突变，均未重复出现.

图1

 

图2

 

 

 

Table2.

 

 

 

讨论：胸腺癌是一种位于前纵隔罕见的肿瘤，所以报道的研究并不像常见肿瘤那么多，并且肿瘤分子学机制、有效的的治疗手段进展非常缓慢^[16]。近期，为了进一步认识胸腺瘤的分子学通路，我们研究了胸腺瘤中EGFR和KRAS突变^[6、12]。但是胸腺瘤的致癌基因任然不明确^[11]。在这项研究中，我们对24例胸腺瘤进行56个肿瘤相关基因检测。胸腺癌中重复发生率最高突变基因为TP53，其次为CDKN2A。胸腺瘤中重复突变率最高的是BRCA1，其次是APC基因。在所有胸腺癌中重复突变的基因里，CDKN2A没有出现在胸腺瘤中。

我们确认了一例存在EGFR19外显子框内缺失突变同时包含TP53第4外显子错义突变的患者，患者是一名41岁女性患者，于2013.11.4 在我科行纵膈肿瘤切除、左右无名静脉、上腔静脉切除、右无名静脉-上腔静脉心包内段切除左侧无名静脉右心耳人造血管重建，主动脉弓鞘膜切除，心包部分切除、右上肺前段楔形切除、纵膈LN切除。病理回报：肿瘤大小5*4.3*3，胸腺鳞癌，侵犯右肺上叶、上腔静脉、左无名静脉、右侧无名静脉，右纵膈淋巴结可见转移癌。Masaoka分期IV期。患者术后行4周期化疗。与去年8月份疾病出现进展，常规复查CT时发现肺部转移病灶。目前口服化疗药替吉奥治疗，肺部转移病灶控制稳定。结合患者基因突变的特点，若口服化疗药一段时间后疾病继续进展，下一步治疗方案可以考虑给予患者使用EGFR靶向治疗药物单药治疗或结合TP53靶向治疗药物，这病患者我们会继续随访。

在我们送检的胸腺瘤患者中，仅有一例A型患者存在多基因突变，保含MTOR、NTRK、NF1、BRCA1、HRAS突变。患者男性，62岁，因间断胸部不适查体发现胸腺占位，于2014.3.在我科行纵膈肿物切除，病理回报：肿瘤大小3.3*3*3 包膜完整，未侵及周围组织，masaoka分期I期。术后患者未行任何辅助治疗，患者目前病情稳定。HRAS是RAS肿瘤基因家族一种小分子G蛋白。HRAS基因突变在很多种肿瘤中都有过报道，包括膀胱癌，滤泡状甲状腺癌、口腔鳞状细胞癌[RefSeq, Jul 2008].有相关研究报道HRAS在头颈部鳞癌中存在高频突变，NF1对RAS传导通路具有负性调节作用。NF1基因突变与I型多发性神经纤维瘤、青年慢性骨髓单核细胞性白血病，以及沃森综合征有密切的关系^[17-19]。有相关研究任务RAS突变可能在胸腺癌的发生中起重要的作用。此患者目前随访时间较短，会进一步跟进。

目前有许多研究认为TCA和B3型胸腺瘤之间不同的分子学特点^[20-22]，胸腺瘤是一种具有组织学异质性同时又存在一定的相关性，WHO分型通过上皮细胞与淋巴细胞的比例对胸腺瘤进行分型。从A型到B3型，肿瘤组织中淋巴细胞的比例逐渐增多，组织学中淋巴细胞成分表现出阶梯样变化的同时肿瘤恶性程度逐渐增高。组织学的这种特征提示我们胸腺瘤可能存在一个逐渐恶化的过程。我们假设在胸腺瘤在分子学通路上是否也具有这样的相关性。相关研究证实TP53可能与肿瘤侵犯性有一定关系^[23-25]，Tp53作为人类肿瘤中突变率最高的肿瘤抑制基因[26]，胸腺瘤并不例外。TP53基因突变与肿瘤恶性程度相关性首先在其他肿瘤的研究被发现[27-28]。尽管胸腺瘤发生率低，研究数据比较分散，多研究结果证实TP53在胸腺癌中的突变率接近30%^[24-25]，在送检的24例胸腺瘤患者中出现重复突变的基因中，我们的测序结果也证实了这一结果，存在突变的9例胸腺癌患者中，有3例存在TP53突变（30%），4例B3型胸腺瘤中有1例存在TP53突变（25%），而其余8例胸腺瘤（A、AB、B1/B2）不存在TP53突变。虽然TP53突变在在胸腺瘤中也有出现，但是重复率很低，并且只出现在1例恶性程度较高的B3型肿瘤中。尽管目前没有针对TP53的靶向治疗药物，但是TP53可能可以作为胸腺癌恶性程度的一个指标.

我们通过是否存在TP53或CDKN2A突变将12例胸腺癌分为两部分，存在TP53或CDKN2A突变的患者共4例（33%），另外8例（67%）胸腺瘤患者包括3例不存在任何基因突变及5例含有其他突变基因的患者，观察终点为PFS，将结果绘制成曲线（图3），我们可以观察到，存在TP53或CDKN2A这组患者PFS曲线与另外一组明显分开，提示存在这两种基因突变的患者可能与较差的预后有关。

 

图3.

有相关研究结果证实TP53突变未出现在B3型胸腺瘤中，提出TP53突变可能可以作为TCA和胸腺瘤的区别标记^[15]。这可能与该研究送检样本量过小有关，在我们的实验中检测到B3型胸腺瘤存在TP53突变，在其他类型胸腺瘤中未检测到TP53突变，结合部分研究中心研究结果，共统计40例A、AB、B1/B2型胸腺瘤，均未未检测到TP53突变（Molecular Profiling of Thymoma and Thymic Carcinoma:Genetic Differences and Potential Novel Therapeutic Targets），所以我们提出假设TP53可能可以作为区别B3型和其他类型胸腺瘤的标记并且与肿瘤恶性程度有一定的相关性。

我们结合另外三项研究数据^[33-35]，通过扩大样本量找到可能与胸腺瘤恶性程度相关的分子学标记，TCA：74例，胸腺瘤：55例（表3）。另外三项研究均采用二代测序的放法对不同数量的胸腺瘤及胸腺癌进行检测(附表1-3)。结合我们研究的数据后发现，在胸腺癌中突变频率最高的是TP53，B3型胸腺瘤偶见突变，但仅出现与B3型胸腺瘤中。其次是CDKN2A，clin-dependent Kinase inhibitor 2A （CDKN2A）首次报道于1994年[29]，CDKN2A是一种肿瘤抑制基因，属于细胞周期调节基因家族[30]。它的作用主要是抑制CDK4/cyclin D 酶的活性并将细胞周期阻断在G1期到S期的进程[31-32]。CDKN2A 在胸腺癌中的突变率为12%，并且在55例胸腺瘤中无一例出现该突变，CyCDKN2A可能作为一种区别胸腺瘤与胸腺癌分子学标记。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Table 3.

 

Thymoma Thymic carcinom

                TP 53 mutaion  CDKN2A mutation   TP53mutatioCDKN2Amutaion

 

References      n  n(%)n(%)    n n(%)   n(%)

Franz Enkner1 et.al37  0(0%)   0(0%)       35  9(26%)    4(12%)

 

Andre L. Moreira et ,al6   0(0%)    0(0%)15  4(24% )    0 (0%)

 

Masayuki Shitara et.al    -       -        -          12   1(8%)0(0%)

 

Our Study    12  3(25%)  2(17%)  12   1(8%)0(0%)

 

 

 

总体上讲胸腺瘤及胸腺癌的发病率低、分子学特征复杂多变，基因突变种类繁多但重复突变基因少，这为胸腺瘤及胸腺癌分子学研究造成一定的阻碍。目前从我们的研究看，与其他恶性肿瘤类似，TP53基因为突变频率最高，并且与胸腺瘤组织学恶性×程度相关，CDKN2A出现频率仅次于TP53，但仅在胸腺癌中被检测到，可能作为区别胸腺瘤和胸腺癌的分子学标记，CDKN2A是否与胸腺癌不良预后相关需要进一步随访和观察。

 

 

 

附表1.

 

附表2.

 

 

附表3.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献：

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