比较Y染色体微缺失与Y染色体正常患者囊胚培养情况

朴琳 刘丽英 郭帅帅

 （沈阳市妇婴医院生殖中心，辽宁 沈阳 110001）

摘要：目的，研究Y染色体微缺失患者与Y染色体正常的患者囊胚形成的差异。方法，回顾性分析IVF-ET助孕101例患者ICSI周期的860枚MII卵子，根据精液质量及Y染色体是否完整分析三组不同精液来源的患者胚胎发育及囊胚形成情况。结果，精液正常组，Y染色体正常少弱精组及Y染色体微缺失少弱精组比较受精率，DAY3胚胎可利用率，DAY3优胚形成率，囊胚形成率，可利用囊胚率及优质囊胚率均无显著性差异，无统计学意义。结论，Y染色体微缺失并未对胚胎的发育及囊胚的形成造成显著性影响。

关键词： Y染色体 微缺失 培养 囊胚形成

基金项目：辽宁省自然科学基金20170540836

科技计划项目：沈阳市科技计划项目NO.F15-159-1-100

目前，世界范围内约有10%-15%的育龄夫妇受到不育症的困扰，其中40%-50%是由男方因素造成的，而约有30%的男性不育患者与遗传因素相关^[1]。在生精障碍的男性不育患者中Y染色体AZF区域微缺失是仅次于Klinefelter综合症居于第二位的遗传因素。AZFa和AZFb区域缺失的患者一般临床表现为无精子症，睾丸穿刺通常也无活动成熟精子，仅可通过供精人工授精或供精试管婴儿技术生育后代。AZFc缺失男性患者临床表现存在变异，可表现为无精子症和严重少弱精症，后者可通过单精子卵浆内注射（ICSI）技术生育后代。有研究报道，AZFc缺失男性患者的后代中AZF缺失区域还有扩大趋势，即其后代的生精功能障碍可能加重，甚至直接表现为无精症而失去生育能力^[2]。为了预防这种出生缺陷在家族中遗传，可以通过胚胎植入前遗传学诊断（PGD/S）技术，即“第三代试管婴儿”，选择性别，生育女孩，从而阻断缺陷基因传递给下一代。

采用PGD/S方法检测胚胎通常有两种方法，卵裂球期活检和囊胚期活检。研究显示，囊胚期活检的胚胎非整倍体率明显下降，移植后能够有效的提高着床率，从而改善临床结局。因此，在治疗周期中获得更多的囊胚是患者成功的基本保证。本研究通过回顾性分析101个周期的患者资料，探讨Y染色体AZFc微缺失的患者在IVF-ET周期中胚胎发育成囊胚的潜能，为进一步提高囊胚质量作指导。

1.对象与方法

研究对象与分组 选择2017年5月至2018年5月在本院生殖中心由于男方因素行ICSI治疗的患者101例，年龄21到42岁，平均年龄33.29±4.27入选标准：（1）在新鲜取卵周期≥2个胚胎行全囊胚培养的周期。（2）患者受精方式采用ICSI的周期。分别按照精液质量以及Y染色体是否完整分为精液质量正常ICSI组，Y染色体正常的严重少弱精ICSI组以及Y染色AZFc微缺失引起的少弱精ICSI组。患者行囊胚培养时均签署“囊胚培养知情同意书”。

2.方法

2.1 精液收集 患者禁欲3-7天取出并液化后采用密度梯度离心法加上游法收集精液，并对少弱精患者进行Y染色体缺失检查，按照WHO第五版标准将精液分为三组精液完全正常组，少弱精患者但Y染色体正常组，少弱精患者但Y染色体AZFc微缺失组。

2.2 采用本中心常规促排卵方案阴道B超监测卵泡直径发育至18mm以上时，注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），36小时后经阴道超声下穿刺取卵。

2.3 囊胚培养和囊胚评级 将D1是2pn并且D3在4个细胞以上且为可利用的胚胎行全囊胚培养，根据Garnder囊胚分级法对形成的囊胚进行分级^[3]。首先根据囊胚的夸张程度和孵出程度将囊胚分为1-6个时期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔体积小于胚胎总体积的1/2。2期：囊胚腔体积大于或等于囊胚总体积的1/2。3期：扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积。4期：囊胚腔完全充满胚胎，胚胎体积变大，透明带变薄。5期：正在孵出，囊胚的一部分从透明带中溢出。6期：囊胚完全从透明带中溢出。处于3-6期的囊胚，还需对其内细胞团和滋养细胞进行分级。内细胞团分级：A级：细胞数目多，排列紧密。B级：细胞数目少，排列松散。C级：细胞数目很少。滋养细胞分级：A级：上皮细胞层由较多细胞组成，结构致密。B级：上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散。C级：上皮细胞层由稀疏的细胞组成，大细胞很少。

2.4 统计学处理  采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用方差分析；计数资料以率表示，采用c²检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3结果

   不同精液的患者囊胚培养情况，本实验共收集101例患者ICSI周期的860枚MII卵子，三组患者的平均年龄分别为（33.57±4.25  33.30±4.65  33.13±4.39）。 按照精液情况及Y染色体是否完整分为三组，精液正常组，Y染色体正常少弱精组及Y染色体AZFc微缺失少弱精组。三组分别收集到MII卵子391，375，94枚，ICSI注射后观察DAY1受精数，DAY3可利用胚胎数，DAY3优质胚胎数，囊胚形成数，可利用囊胚数，以及优质囊胚形成数（见表1）进行比较，三组患者受精率，DAY3可利用胚胎率，DAY3优质胚胎率，囊胚形成率，可利用囊胚率，优质囊胚率(见表2)均无显著性差异（P>0.05），无统计学意义。Y染色体微缺失并未对胚胎的发育造成显著性影响。

表1

备注：DAY3可利用胚胎数：形态学评分为三级级三级以上胚胎。DAY3优胚数：形态学评分为二级及二级以上胚胎。成囊胚数：2期及2期以上囊胚。可利用囊胚数：3期及3期以上至少含有1个B的胚胎，优质囊胚数：3期及3期以上不含C的胚胎。

表2

备注：受精率=受精数/MII数，D3可利用率=D3可利用胚胎数/受精数，D3优胚率=D3优胚数/受精数，成囊率=成囊数/D3可利用胚胎数，可利用囊胚率=可利用囊胚数/D3可利用胚胎数，优质囊胚率=优质囊胚数/D3可利用胚胎数。

4讨论

   1990年报道了首例应用移植前基因诊断鉴定性别后^[4]，辅助生殖移植前诊断技术得到了飞速的发展，进行了许多改变，但是胚胎种植率和临床妊娠率仍不尽人意。现今，囊胚发育程度影响移植结局的观点比较一致^[5]，那么，获得更多更优质的囊胚就成为了我们面临的一项新课题。人类胚胎的体外培养，首先经历了卵裂期胚胎，然后再到种植前的囊胚期胚胎，在这个发育过程中，胚胎经历了细胞的融合期，囊胚腔的出现以及囊胚腔的扩张直至囊胚浮出。同时，在整个过程中，基因调控经历了母体调节向胚胎调节的转换^[6-7]，这是一个多基因控制的复杂过程。Y染色体AZFc区在这个过程中是否起调控作用目前尚不明确。但是在胚胎的后期发育过程中，Dewan等^[8]研究认为,Y染色体的完整性在胚胎的发育和维持妊娠中发挥重要作用，Y染色体的微缺失可能是引起反复自然流产（RSA）的原因。Karaer^[9]等的研究同样认为Y染色体AZF的微缺失可能是引起RSA的原因之一。而在Kaare^[10]和卢洪涌^[11]的研究中均排除了AZF微缺失为RSA 的原因。所以，我们应对Y染色体AZFc微缺失高度重视，它可能在临床应用中起重要作用。本研究主要研究Y染色体AZFc微缺失在胚胎发育成囊胚中的作用。收集到的737枚受精卵发育过程中，在D3可利用胚胎率，D3的优质胚胎率，成囊胚率，可利用囊胚率，以及优质胚胎率，均无显著性差异，无统计学意义。当然这只是对胚胎发育成囊胚阶段而言，现要弄清Y染色体AZFc微缺失与胚胎发育的确切机制，还有待于分子生物学水平的进一步研究。

 参考文献

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