3D打印钛合金牙种植体的细胞毒性的研究

Study of the cytotoxicity  for 3D printed titanium alloy dental implants

王骅¹王鹞²     张彪³

1.芜湖市口腔医院芜湖 241000            2.吉林大学口腔医院种植中心长春 1300213.芜湖市口腔医院芜湖  241000

安徽省教育厅科学基金项目 项目编号 (KJ2016A422)

摘要：目的 利用MTT比色实验，检测以3D打印技术铸造出的钛合金牙种植体的细胞毒性，评测新性铸造工艺的可行性，为下一步的临床应用提供理论依据。方法 我们以专业软件设计建立计算机模型，选取Ti-6Al-4V、Ti-6Al-7N两种不同的钛合金作为铸造原材料，以3D打印技术铸造出同样规格的三种实验标准片。实验主要分为3组，即Ti-6Al-4V组、Ti-6Al-7Nb组、空白对照组。通过MTT比色实验方法，我们分别检测了这三种标准件对于成骨细胞MG63增殖率的影响，来完成对于3D打印技术的评价。结果 在倒置相差显微镜下我们观察到：三组细胞的生长状态均良好，实验组与空白对照组相比，细胞形态无显著区别。MTT比色结果显示，两组钛片的细胞毒性分级均为0级，同时，Ti-6Al-7Nb钛合金片增殖率略高于Ti-6Al-4V钛合金片浸提液组。结论通过3D打印技术铸造出的的钛合金种植体，其细胞毒性水平满足口腔种植材料临床应用的要求，且Ti-6Al-7Nb的细胞毒性水平略低于Ti-6Al-4V。

关键词：3d打印   TC4  牙种植体细胞毒性

Wang Hua¹, Wang Yao²,Zhang Biao³. (1. Hospital  of  Stomatology  Wuhu  Cistyl,Wuhu 241000 2. Dept. of Implant Center, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021      4.Hospital  of  Stomatology  Wuhu  Cistyl,Wuhu 241000, )

· Abstract:ObjectiveInvestigate the cytotoxicity of 3D printed titanium alloy dental implants . Methods Design dental implants computer model and choose  Ti-6Al-4V，Ti-6Al-7Nb as material to cast dental implants using laser melting 3D printing technology. Set Ti-6Al-4V as group A, Ti-6Al-7Nb as group B and blank control group. The OD value and relative growth rate(RGR) of MG-63 were measured through MTT test. Results Result of laser rapid prototyping 3D printing technology can produce personalized dental implants with different shapes. MG-63 cell grew strongly in two kinds of fluid and have not showed difference. The OD value and relative growth rate of the blank control group were little higher than titanium alloy group with MTY test，but there was no significant difference between the two groups. The level of cytotoxicity was grade 0. Conclusion There was no statistical difference between the blank control group and the titanium alloy of implant(P>0.05). The results of experiment prove that 3D printing dental implant is in line with the requirement of its clinical application and Ti-6Al-7Nb has lower level of cytotoxicity than Ti-6Al-4V.

Key words:3D printing; implant;TC4; cytotoxicity

用钛合金材料，运用3D打印工艺制作的牙种植体，具有数字智能化、网络定制化、高度个性化等特点，是口腔种植学科未来发展的方向。

1.1 材料和设备

1.1.1 材料：Ti-6Al-4V、Ti-6Al-7Nb钛合金粉（3D systems公司）

1.1.2 设备：Prox100金属直接打印机； SW-CJ-IF超净工作台（苏净安泰公司）； SC-3610低速离心机（ZONKIA公司）； MCP-17AIC 二氧化碳恒温培养箱（SANYO公司）

1.2   3d打印牙种植体方法

运用UG计算机三维设计建模软件设计个性化牙种植体（4.5mm×10mm圆柱型）和实验性钛片（25mm×5mm圆形），建立牙种植体和实验性钛片标准件数据模型，三维模型导出为STL格式，导入设备控制软件，执行生成标准打印格式的文件，数据虚拟切层，设置层厚度为0.08mm。分别在Prox 100 3D打印机上经过逐层熔结叠加完成Ti-6Al-4V、Ti-6Al-7Nb牙种植体和实验钛片各3件。

图1  3d打印种植体

图2   3d打印钛片

1.3细胞毒性实验方法：

1.3.1浸提液制备:使用丙酮及无水乙醇超声震荡清洗钛片，再用紫外线消毒分别各个面。按照样品表面积:溶液体积3cm²/ml的比例，用相应体积的含10%胎牛血清的无菌DMEM培养基浸泡钛片，37°C、5%CO孵育96 h，待金属离子充分析出后，将浸提液用0.22μm微孔筛网过滤，密封于EP管中，4°C贮存。

1.3.2  试样分组:共分3组，A组(加入Ti-6Al-7Nb钛片浸提液组)；B组(加入Ti-6Al-4V钛片浸提液组); C组为空白对照组，每组实验钛片各3件。

1.3..3  MTT比色实验

用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养液培养MG63细胞至对数生长期，0.25%胰蛋白酶将其消化，移液枪吹打后，重悬制得细胞密度约为8×10⁴/ml的单细胞悬液，以8000个/孔的数量铺板于96孔板。在板中选取30个孔，分成3组，每组10孔，37°C、5%C02条件下培养24 h，显微镜下观察细胞生长情况，确认贴壁后丢弃原培养液，使用PBS溶液冲洗，每孔3遍。将之前准备好的两种浸提液以及普通培养液加入对应组，放入孵育箱 48h后观察细胞形态，拍照记录。以每孔20μl的量加入MTT20后，放入恒温培养箱培养，4h后弃净孔内的液体，每孔再加入150μl DMSO，使用微量振荡器振荡10 min， 490 nm波长下测定各孔OD值。

1.3..4  细胞相对增殖率及毒性评价：通过OD值计算细胞相对增值率（relative growth rate，RGR）计算公式：RGR(%)=(实验组OD值/培养基OD值)×100，然后根据5级毒性标准分级（表1），对检测结果分级。

1.3.5统计学处理：采用Excel 2007及SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以X±s表示，采用方差分析及LSD检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.实验结果

    2.1细胞形态学观察
24h后两组细胞贴壁生长，折光性强，细胞形态主要呈梭形及多角形。两组细胞轮廓清晰，生长旺盛，排列密集规则，镜下未见有明显差异。（见下图）

2.2   MTT实验结果

表2  MTT比色检测细胞活性结果表

根据表2、表3数据，SPSS分析后实验组和对照组对比无统计学差异(P<0.05)。Ti-6Al-7Nb组的RGR≈97%，细胞毒性为0级，Ti-6Al-4V组的RGR≈88%，细胞毒性为0级。

3.讨论

口腔种植是一种应用广泛的口腔缺牙修复手段，在这一技术中，对于用来铸造种植体的材料，医学界有着严格的要求。被学术界所公认的是，用于铸造口腔种植体的材料应具有良好的机械性能、稳定的物理化学性状，以及出色的生物相容性 ^[1]   。目前，临床上常见的牙种植体，其铸造材料主要有金属及其合金、陶瓷、高分子材料和碳这几类。其中，钛和钛合金是使用最为广泛的材料。钛不仅拥有良好的生物相容性，其骨整合和生物结合能力也是目前已知的材料中最好的。室温(25°C)下的钛，其内部为密排六方晶体结构(HCP)，称做á相。当环境温度达到 883°C时，钛便可变为体心立方晶体结构(BCC) 称â相^[2]。目前被广泛应用于牙种植体的Ti-6Al-4V^[3-8]。钛合金Ti-6Al-4V 在室温(25°C) 下内部同时存在á相和â相两种晶体结构，同时合金中其他的元素，可影响á相和â相的相互转化，从而在一定程度上决定两者的比例^[9]。现阶段相关研究表明，钛种植体的 5年、10年、16年的远期成功率分别可达到 94.5%、89%、82%^[10]。大量的实验已经证明，钛合金无论是在生物安全性还是抗腐蚀性上，相比不锈钢或钴合金，占有很大的优势。然而，以Ti–6Al–4V 为代表的第一代钛合金材料，仍有关于其在植入后引起人体过敏反应的报道^[11]。研究证明，从Ti–6Al–4V中长期释放的铝和钒，被证明与阿尔兹海默症等神经性疾病的发生有显著的相关性。所以，很多不含有钒的合金，如Ti–6Al–7Nb和Ti–5Al–2.5Fe 被开发出来。由于第一代钛合金材料存在的这些缺点，第二代钛合金——â型钛合金，近年来受到学术界越来越多的关注。对于一种钛合金材料，其生物相容性及机械性质，除了与其本身成分有关，还与其加工工艺有着密切的关系。由于钛在大气中极易被氧化，易在表面形成一层以 TiO₂为主要成分的氧化膜。在这层氧化膜中，随深度的变化,氧化物的成分也会略有不同，主流观点认为，氧化膜的存在与钛优异的抗腐蚀性有着密切关系。所以，大多数临床医生在口腔牙种植前会对钛进行表面的钝化膜增厚处理。常用的方法有化学氧化法、阳极氧化法以及大气加热法^[12]，这些预处理可以增加氧化膜的厚度, 提高钛的稳定性。

近年来，我们不难发现，定制型医疗服务正在逐渐成为医学领域一个重要的发展趋势。为患者量身定做的人工植入物，由于其定制化、个性化的特点，受到越来越多医疗工作者们的重视^{[13]- [14]}。然而，传统的制造工艺无法满足个性化种植体其高特异性、低单件成本等要求，要想实现个性化修复的普及，我们急需一种新的铸造技术。3d打印是目前公认的，最适合个性化植入物的铸造技术^[15,16]，该技术可在较短时间内制造出几何形态复杂、孔隙结构梯度变化的金属材料，非常适用于铸造精细的种植体。3d打印个性化牙种植体的主要优点有：（1）解剖形态结构与缺失牙更匹配，增加了种植体的手术初期稳定性，从而提高了种植成功率。（2）可以直接修复缺失牙的美容需求，尤其是前牙缺失牙。（3）与缺牙创更贴合有效地解决了手术微创，减轻了患者的痛苦，避免了创口愈合过程中的骨丧失。（4）省略了传统模具制作的耗时与成本，真正做到了节能环保。(5)3d打印工艺可制作表面形态多样，孔隙结构变化，材料成分合理，工艺技术先进，大大提高了种植体的生物相容性。

在这次实验中，我们尝试使用了Ti-6Al-4V、Ti-6Al-7N两种临床上常用的钛合金材料，使用3D打印技术制造出了两枚实验性钛片标准件。为了验证此项工艺的临床安全性，我们首先对标准件进行了体外的细胞毒性检测。通过MTT比色实验，我们证明了两组钛片标准件的细胞毒性均为0级，同时，两者相比之下，Ti-6Al-7N生物相容性更胜一筹。

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