依达拉奉注射液中有关物质的检测

杨清举¹，张弘²

（1. 金堂县第一人民医院·四川大学华西医院金堂医院，四川  金堂  610400；

2. 成都瑞特恩科技有限公司，四川  成都  611731）

摘要:  目的  建立以HPLC法检测依达拉奉注射液中有关物质的方法。 方法  采用C₁₈（250×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以0.02 mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（55:45），20%磷酸调节pH3.0为流动相A；以0.02 mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（25:75），20%磷酸调节pH3.0为流动相B，进行梯度洗脱。流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，检测波长245 nm。以主成分自身对照法计算有关物质含量。结果  该色谱条件下，主成分与有关物质能完全分离，各杂质峰分离良好。结论  该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于该制剂中有关物质的检测。

关键词: 依达拉奉注射液；有关物质；梯度洗脱；高效液相色谱法

 Determination of related substances in Edaravone Injection

Yang Qingju¹ , Zhang Hong²

（ 1.Jintang Hospital Affilated to West China Hospital of Sichuan University, Jintang First People’Hospital ,Jintang, sichuan, China  610400;2.Rakon Technologies Ltd.,Chengdu, sichuan, China  611731)

Abstract  Objective  To establish an HPLC method for the determination of related substances in Edaravone Iniection. Methods  The analytical column was TIANHE Kromail C₁₈ column(250×4.6 mm，5 μm). The mobile phase A consisted of 0.02mol/L Ammonium dihydrogen phosphate -methanol (55:45), (20% phosphoric acid,pH=3.0);The mobile phase B consisted of 0.02 mol/L Ammonium dihydrogen phosphate -methanol (25:75), (20% phosphoric acid,pH=3.0), gradient elution at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 245 nm and the column temperature was maintained at 35℃. The content of related substance was calculated by self- control with main component. Results  Related substances were completely separated from the main constituent and the impurities were separated well from each other. Conclusion  The method is specific,sensitive and reproducible for the determination of related substances in Edaravone Injection.

Key words: Edaravone injection；Related substances；Gradient elution；HPLC

依达拉奉(edaravone，3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉-5-酮)，是以苯肼和乙酰乙酸乙酯为原料合成的吡唑啉酮类化合物，是第一个用于治疗急性缺血性脑卒中的强效自由基清除剂。可作用于脑梗死前期，抑制脑水肿、缩小脑梗死区、减轻神经症候群的发作，保护脑组织的结构和功能^[1-2]。近年来，有关依达拉奉治疗肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病^[3]等的临床研究正在进行中，抗癫痫、抗类风湿性关节炎和抗纤维化作用在临床实践中被发现，其对人类多种疾病的有效性说明此药具有广阔的开发前景^[4-5]。自2001年由日本三菱田边制药公司研发上市后已经在全球范围内得到了广泛使用。药物制剂中有关物质的检测是其质量研究的重要方面，在综合国内外文献^[6-10] 基础上建立高效液相色谱梯度洗脱分离的检测方法，对依达拉奉注射液进行可靠、有效的质量控制。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司Aglient1260和Aglient1160）。依达拉奉注射液（批号分别为140101，140201,140202，140203，成都天台山制药有限公司）。依达拉奉对照品（纯度99.9%，中国食品药品检定研究院）。杂质P1（纯度99.63%，成都瑞特恩科技有限公司）。杂质P3（纯度99.07%，成都瑞特恩科技有限公司）。双吡唑啉酮（纯度为98%，Alfa Aesar A Johnson Matthey Company）。依达拉奉三聚物（批号为Z20130225，深圳振强生物科技有限公司）。磷酸二氢铵、磷酸均为分析纯，甲醇为色谱纯；实验中所用水均为超纯水。

2 方法与结果 

2.1 色谱条件  色谱柱：C₁₈（250×4.6mm，5μm）。 流动相：以0.02 mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（55:45）(用20%磷酸溶液调节pH为3.0 )为流动相A，以0.02 mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（25:75）(用20%磷酸溶液调节pH为3.0 )为流动相B，梯度洗脱程序见表1。流速为1.0 ml/min，柱温：35℃，检测波长为245 nm。进样量为20 µl。

2.2 溶液的制备  

2.2.1 系统适应性溶液  双吡唑啉酮贮备液：称取双吡唑啉酮对照品约12.5 mg，置于25 ml量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺超声使溶解并稀释至刻度，再精密量取1 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。杂质P1贮备液：称取杂质P1对照品约10 mg置于50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。杂质P3贮备液：称取杂质P3对照品约12.5 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，再精密量取1 ml置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。系统适用性试验溶液：称取依达拉奉对照品5 mg置于100 ml量瓶中，精密加入双吡唑啉酮贮备液、杂质P1贮备液1 ml和杂质P3贮备液各1ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀即得。因三聚物结构式的空间位阻较大，不易形成，且在本品稳定性研究中三聚物均未检出，将三聚物按未知杂质控制。三聚物对照品只用于色谱条件专属性研究。

2.2.2 供试品溶液和0.5%对照溶液  精密量取依达拉奉注射液3.0 ml，置10 ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液0.5 ml，置100 ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验   分别取空白辅料溶液（除依达拉奉主药外，其他均按处方配制）、系统适应性溶液以及供试品溶液各20 µl，进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，空白辅料对各有关物质的测定均无干扰，依达拉奉与各已知杂质(双吡唑啉酮、三聚物、杂质P1和P3)之间均分离良好，杂质与杂质之间的分离度均符合要求，依达拉奉峰与杂质P3峰的分离度为3.94。表明本法的专属性良好。色谱图见图1。                         

2.3.2 破坏性试验   取依达拉奉注射液（批号为140101）1.0 ml（共5份），分别置于5个25ml容量瓶中，进行不同条件下的降解试验。空白辅料样品制备方法：取缺少依达拉奉主药的按处方工艺制备的空白辅料溶液1.0 ml，同样品制备方法。第1份为未经破坏的样品；第2份加10%H₂O₂ 1 ml，80℃水浴中放置15 min，作为氧化破坏样品；第3份加1 ml 6 mol/LHCl，于80℃水浴中加热26.5h后调pH值至中性，作为酸破坏样品；第4份加1 ml  6mol/LNaOH，于80 ℃水浴中加热5 h后调pH值至中性作为碱破坏样品；第5份加水5 ml后置于80℃水浴中加热25.5h，作为热破坏样品。5种条件下的样品均用流动相A定容至刻度。检测结果表明空白辅料在主峰相对保留时间约0.35倍有峰出现，但酸、碱、热及氧化条件下降解产物保留时间均在辅料峰后，因此有关物质测定时，可扣除辅料峰，即主峰相对保留时间约0.35倍之前的峰。结果表明不同破坏性条件下产生的杂质对依达拉奉有关物质的测定无干扰，且各降解产物之间及与主峰之间的分离均较好，物料平衡，辅料无干扰且无明显降解产物；在酸、碱、热条件下，本品较稳定，但在剧烈的氧化条件下，主成分易降解。说明拟定的色谱条件能够满足本品有关物质的有效检出。

2.3.3 检测限和定量限的测定  取本品及各已知杂质对照品适量，加甲醇溶解作为各样品储备液，取各样品储备液用流动相A逐级稀释，进样量均为20 μl。当信噪比为10:1时，作为各样品的定量限；当信噪比为3:1时，作为各样品的检测限。计算结果显示各杂质的检测限均较低，本品拟定的进样浓度为0.45 mg/ml，进样体积为20 μl；信噪比为3:1，保证大于0.02%的杂质能被检出；能保证样品中高于0.01%的未知杂质、0.006%的双吡唑啉酮、0.001%的P1、0.01%的P3、0.01%的三聚物被检出。表明拟定的进样量及进样浓度能够保证本品各杂质的有效检出，满足质控要求。

2.3.4 线性关系的考察  分别称取依达拉奉对照品及各已知杂质对照品适量，分别用甲醇和流动相A溶解并稀释制成一系列浓度的溶液，分别进样20 μl，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得到各组分的线性方程。结果表明依达拉奉、双吡唑啉酮、杂质P1、杂质P3及三聚物的线性均较好，相关系数R≥0.999。依达拉奉在1.5 μg/ml~12.0 μg/ml浓度范围内，线性方程为y=84.974x+1.904 9，r²=0.999 8；双吡唑啉酮在0.3μg/ml~1.7 μg/ml浓度范围内，线性方程为y=79.867x-3.088 9，r²=0.999 9；杂质P1在1.0 μg/ml~8.5 μg/ml浓度范围内，线性方程为y=42.508x+3.488 4，r²=0.999 8；杂质P3在0.3μg/ml~2.3μg/ml浓度范围内，线性方程为y=39.103x-0.678 9，r²=0.999 6；三聚物在0.2μg/ml~3μg/ml浓度范围内，线性方程为y=77.8889x+0.476 8，r²=0.999 7。

2.3.5 杂质的加样回收试验  精密量取依达拉奉注射液（批号为140101）3.0 ml置10 ml容量瓶中，按样品定限量浓度的80%、100%、120%的量加入杂质对照品溶液。按“2.1”项方法测定有关物质，每个浓度平行测定3份，回收率结果见表2。结果表明各已知杂质不同浓度的平均回收率均在90%~110%之间，且回收率RSD均小于5%。

2.3.6 精密度试验  取依达拉奉注射液（批号为140101）适量，按“2.2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液和0.5%对照溶液，依法测定，6份样品的有关物质检出结果基本一致，重复性良好。杂质P1、杂质P3、双吡唑啉酮、未知杂质及总杂质的RSD均小于2.4%；由不同试验人员分别建立不同色谱系统，分别连续测定6份同批号（批号为140101）的样品，结果12份样品的有关物质检出结果基本一致，表明本法的精密度较好；分别取依达拉奉对照品和各已知杂质对照品适量，用甲醇和流动相A溶解并稀释配制成一定浓度的溶液，连续进样6次。结果表明进样精密度良好，已知杂质对照品溶液、0.5%自身对照溶液峰面积RSD均小于0.9%。

2.3.7 溶液稳定性

2.3.7.1 对照品溶液放置稳定性   取杂质P1、杂质P3对照品适量，用甲醇和流动相A溶解并稀释至分别含4μg/ml和1μg/ml的溶液，将该杂质对照品溶液室温放置0、1、2.5、4、6、7、8h后取20μl进样，记录色谱图；取依达拉奉对照品、双吡唑啉酮对照品适量，用甲醇（其中双吡唑啉酮用N,N-二甲基甲酰胺溶解）和流动相A溶解并稀释至分别含1μg/ml的溶液，将该杂质对照溶液室温放置0、2、4、6、7、8h后取20μl进样，记录色谱图；结果表明各杂质峰面积的RSD均小于1.1%，说明有关物质测定各杂质对照溶液室温放置8小时稳定。

2.3.7.2 有关物质供试品溶液及自身对照溶液放置稳定性   按“2.2.2”项下制备供试品溶液和0.5 %对照溶液，分别在室温下放置0、2.5、5.3、8、14.3、18.5 h后，取20 μl进样，记录色谱图，并按主成分自身对照法计算峰面积的RSD值。结果表明各杂质峰面积的RSD均小于5.0 %。说明依达拉奉注射液有关物质检测供试品溶液及0.5 %自身对照溶液室温放置18.5小时稳定。

2.3.8 色谱条件耐用性试验  在“2.1”项色谱条件的基础上，分别对流动相的组成、流动相pH、流速、柱温、检测波长进行耐用性考察（由于杂质P3与主峰最近，其它杂质与主峰及各杂质之间分离均较好，故耐用性试验中主要考察依达拉奉与杂质P3之间的分离度）。结果显示本品有关物质检测方法中流速、柱温、流动相pH值、流动相B比例及检测波长等因素的适当变化，杂质P3与依达拉奉的分离度均较好（R>3.5），各杂质的检出量基本一致。流动相A中甲醇比例越大，保留时间略提前，依达拉奉和杂质P3的分离度越差，但各杂质检出量基本一致。

2.供试品含量测定 取3批依达拉奉注射液预中试样品，按照 “2.2.1”项下的样品制备方法和“2.1”项下的色谱条件进行有关物质检测，测定结果见表3。结果显示依达拉奉注射液中总杂质含量均不大于1.0 %。

3讨论  

3.1检测波长的选择  通过对主药依达拉奉和各已知杂质（双吡唑啉酮、三聚体、杂质 P1 和P3）分别进行紫外扫描，结果表明各组分在245 nm波长处吸收较近；并且在样品的破坏性试验中表明波长245 nm下的降解杂质的检出率略高于240 nm下的检出情况，故以245 nm作为有关物质的检测波长。

3.2分析方法的比较  取本品及原研制剂分别按照自研方法及国外药典^[11]收录的依达拉奉有关物质检测方法进行测定，对比考察不同方法下有关物质的检测情况，结果表明自研方法中的杂质检出量较国外药典多，且各杂质间的分离度均较好；日本药典收载的检测方法没有明确检测的目标杂质且色谱条件不能完全重现已知杂质的相对保留时间；且苯肼作为合成本品的起始物料，其最大吸收波长（224 nm）与其他已知杂质以及主药的最大吸收波长（240～245 nm）相差较大，在同一色谱条件下不能检测出苯肼的真实量，因此单独建立方法进行苯肼的控制。

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