氧化白藜芦醇抑制肝癌作用机制的研究 ^*

宋英奇，马帅静，晏晓杰，黄小丹，文济刚，周黎明^**

（四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都，610041）

摘要 目的：探讨氧化白藜芦醇对人肝癌细胞的抑制作用及其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和CCK-8法检测氧化白藜芦醇对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞增殖的影响；划痕实验、Transwell侵袭实验观察氧化白藜芦醇对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响； Western Blot检测氧化白藜芦醇处理肝癌细胞后p62和LC3蛋白的表达。结果：氧化白藜芦醇对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞的IC₅₀值分别为38.5μg/mL、20.6μg/mL，且增殖抑制效果呈剂量依赖性。氧化白藜芦醇能够抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和自噬。结论：氧化白藜芦醇能够显著抑制体外人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞增殖、迁移、侵袭和自噬。

关键词  氧化白藜芦醇；肝癌；转移

Study on effects and mechanism of Oxyresveratrol on inhibiting hepatocellular carcinoma

Abstract：Objective: To investigate the inhibitory effect and mechanism of oxyresveratrol on human hepatocellular carcinoma. Methods: MTT assay and CCK-8 assay were used to to detect the inhibitory effect of oxyresveratrol on human hepatic cell line HepG2 and SMMC-7721 proliferation in vitro. Wound Healing was used to assay the effect of oxyresveratrol on migration ability of liver cancer cells and the cell invasive capacities were determined by Transwell assay. The protein expression levels of p62 and LC3 in liver cancer cells were detected by Western Blot. Results: The IC₅₀ of oxyresveratrol for the hepatic cell line HepG2 was 38.5μg/mL and SMMC-7721 was 20.6μg/mL, it could inhibit the proliferation of liver cancer cells in a concentration-dependent manner. Oxyresveratrol could inhibit migration , invasion and autophagy of liver cancer cells. Conclusion: These findings suggest that Oxyresveratrol could inhibit the proliferative，migration , invasive and autophagy capacities of HepG2 and SMMC-7721 cells in vitro.

Key words Oxyresveratrol; hepatocellular carcinoma; metastasis

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是发病率和死亡率最高的癌症之一，我国每年死于肝癌的人数占全球肝癌死亡病例数的一半以上^[1]。肝癌的特点是起病隐匿、易转移、易复发^[2]，这给肝癌的预防和治疗增加了很大的困难，且肝癌确切的发病机制至今尚未完全明确。目前, 尽管肝癌的治疗方式在手术、局部消融治疗、TACE 治疗、化疗、放疗及靶向治疗等^[3]已经取得了很大进展，但肝癌的预后依然很差。

氧化白藜芦醇（Oxyresveratrol）是一种多羟基苯乙烯^[3]，存在于多种植物中，目前主要从葡萄、虎杖、花生、桑树等植物中提取^[4]，能快速被机体吸收并发挥抗炎^[5，6]、抗氧化^[7-9]、抗病毒^[10,11]、抗肿瘤^[12,13]、抑制酪氨酸活性^[14,15]、神经保护^[16,17]、抗褐变^[18]、美白^[19]等作用。氧化白藜芦醇因具有独特的生物学活性，毒副作用小，安全性高，已经逐渐被医学领域所关注。本文主要研究氧化白藜芦醇在体外对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞活性、迁移及侵袭等的抑制和对自噬作用的影响，为氧化白藜芦醇对肝癌的临床治疗提供一定的实验数据。

图1 氧化白藜芦醇（Oxyresveratrol）

^* 基金项目：四川大学“大学生创新创业训练计划”研究项目(编号：C2018103393).

^** 通讯作者

1  材料和方法

1.1试验药物

氧化白藜芦醇（Oxyres）(含有量＞98%)由四川大学药学院王峰鹏教授提供，DMSO配置为100mg/mL储备液，用时再稀释至不同浓度。

1.2细胞

人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞，传代保存于四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室。

1.3试剂

DMEM培养基（美国HyClone公司），青链霉素混合液（美国HyClone公司），胎牛血清（上海生工生物工程股份有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）、CCK-8(日本DOJINDO公司)。p62、LC3单克隆抗体（MEDICAL &BIOLOGICAL LABORATORIE CO.,LTD. MBL），辣根过氧化酶标记的羊抗兔、抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.4仪器

CO₂培养箱，日本SANYO公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；荧光倒置显微镜，日本Nikon公司；全自动酶标仪（型号DNM-9602G），北京普朗新技术有限公司；Power Pac TM Basic 电泳仪电源，美国Bio-Rad公司；细胞培养瓶、6孔、96孔平底板，耐思生物科技有限公司；BD Transwell小室，美国 Corning公司。

1.5方法

1.5.1细胞培养

人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞贴壁培养于含10%的胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养液中，在含5% CO₂、37℃的培养箱中培养，48h换液一次，72h传代一次。

1.5.2 MTT和CCK-8实验

将对数生长期的HepG2、SMMC-7721细胞以2×10³个/cm²的密度接种到96孔板中，每孔200μL，细胞密度达80%左右时，根据预实验结果分组，更换为氧化白藜芦醇浓度分别为 0、6.25、12.5、25、50μg /mL的含药培养基，每个浓度组设３个复孔。继续培养 24h和48h后，更换为无血清培养基，避光条件下每孔加入5mg/mL 体积为20μL的MTT溶液或20μL CCK-8溶液，继续于37℃培养4h，MTT、CCK-8用酶标仪测量波长分别在570nm、450nm处的吸光度值。按下述公式计算氧化白藜芦醇对HepG2、SMMC-7721细胞增殖的抑制率。抑制率（%）=（对照组 OD - 加药组 OD）/ 对照组 OD×100%。实验重复3次，取平均值并计算药物半数抑制浓度IC₅₀值。

1.5.3划痕实验

将对数生长期的HepG2、SMMC-7721细胞消化后接种到6孔板中，细胞密度达到90%左右后，用200μL枪头垂直于孔板划痕，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，分别加入氧化白藜芦醇浓度为 0、12.5、25μg/mL的含药无血清培养基，5% CO₂、37℃培养箱中培养，0h、24h后取出细胞，显微镜下观察并拍照，根据收集的图片数据使用Image J软件分析实验结果。

1.5.4  Transwell侵袭实验

在Transwell小室上室内铺以DMEM培养基1:8稀释后的Matrigel胶，水化过夜，接种细胞（密度为5×10⁵个/mL），并分别加入100μL无血清含药培养基至氧化白藜芦醇终浓度为 0、12.5、25μg/mL，每个浓度三个复孔，下室加入500μL完全培养基，常规培养，结晶紫染色，12h和24h显微镜下观察细胞侵袭情况。

1.5.5 Western Blot

将对数生长期的HepG2、SMMC-7721细胞消化后接种到6孔板中, 细胞密度达到80%左右时，分别加入氧化白藜芦醇浓度为 0、12.5、25μg/mL 的含药培养基，培养48h后，用预冷的PBS 洗2 次，加入RIPA 裂解液裂解，以BCA法定量，进行Western Blot实验，检测p62和LC3蛋白的表达，β-Actin蛋白作为内参。使用Image J软件对结果进行分析。

1.5.6统计处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（`x±s）表示，各组间计量资料采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1氧化白藜芦醇对肝癌细胞增殖的影响

MTT法和CCK-8法检测结果显示氧化白藜芦醇能明显抑制肝癌细胞的增殖。与对照组相比，经浓度为6.25、12.5、25、50μg/mL氧化白藜芦醇处理的肝癌细胞抑制率显著增加，并且随着氧化白藜芦醇浓度的增加，抑制肝癌的作用越强。实验可得氧化白藜芦醇对肝癌HepG2、SMMC-7721细胞作用48h后半数抑制浓度IC₅₀为38.5μg/mL、20.6μg/mL。该结果表明氧化白藜芦醇能够显著抑制肝癌HepG2、SMMC-7721细胞的增殖，其抑制作用呈剂量依赖性。（表1）

表1 氧化白藜芦醇对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721细胞增殖的影响（ `x±s，n=3）

与对照组比较 * P＜0.05, ** P＜0.01（下同）

2．2氧化白藜芦醇对肝癌细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示氧化白藜芦醇能明显抑制肝癌细胞的迁移能力。细胞划痕实验是一种研究细胞迁移的体外常用实验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程^[20],伤口愈合程度的大小表示细胞迁移能力的强弱。由图2（A）可以看出，与对照组相比，12.5、25μg/mL氧化白藜芦醇组划痕损伤愈合的趋势明显减少（P＜0.05）。

2．3氧化白藜芦醇对肝癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示氧化白藜芦醇能明显抑制肝癌细胞的侵袭能力。肝癌细胞需要分泌基质金属蛋白酶来水解Matrigel穿过基膜，紫色部分为结晶紫染色的穿到下层的细胞，穿过的细胞数越多，表明细胞的侵袭能力越强。由图2（B）可以看出，与对照组比较， 12.5、25μg/mL氧化白藜芦醇组穿膜细胞数明显减少（P＜0.05），表明氧化白藜芦醇可降低肝癌细胞的侵袭能力。

图2 氧化白藜芦醇对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞迁移（A）、侵袭（B）能力的影响

表2氧化白藜芦醇对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721细胞迁移、侵袭能力的影响（`x±s，n=3）

2．4氧化白藜芦醇对p62和LC3表达的影响

Western Blot结果显示氧化白藜芦醇能明显抑制肝癌细胞的自噬能力，由图3可以看出，与对照组相比，氧化白藜芦醇组的HepG2细胞中，抑制自噬蛋白p62表达明显增加，而促进自噬蛋白LC3表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 氧化白藜芦醇对人肝癌HepG2细胞p62和LC3表达的影响

3.讨论

肝癌是我国癌症相关死亡的主要原因之一，肝癌的主要病因是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，但非病毒相关性肝癌的发生率也在迅速增加。目前，尽管在基因组治疗、靶向治疗和微环境治疗肿瘤上都取得了较大的进展，但是肝癌作为一种高转移性致命的疾病，发现时多为晚期，这一时期对常规化疗和放疗具有很强的耐药性，错过了疾病治疗的最佳时间，且只有少数的患者适合切除性手术治疗。

肝癌的转移率非常高，这也导致了它和许多癌症一样，患病后的生存率与检测时间密切相关。如果HCC处于早期阶段就被发现，存活率就能高达50%左右，所以抑制其转移能够为患者提供宝贵的生存时间。

反式二苯乙烯类化合物具有广谱抗癌活性，能够抑制处于各种阶段的癌细胞^[21]，对于治疗肿瘤、心血管疾病、糖尿病等具有明显的效果。白藜芦醇具有典型的反式二苯乙烯类化合物的结构，发现于红葡萄与红酒中，是一种具有很好疗效的抗肿瘤、抗氧化的物质^[22]，一度成为研究的焦点。氧化白藜芦醇是一种天然活性的有效成分，因其是白藜芦醇的结构类似物，以及教研室的前期研究结果表明氧化白藜芦醇能够抑制小鼠肝癌移植实体瘤的生长及转移等^{[12，23，24]}，故在本研究中我们使用不同浓度的氧化白藜芦醇对人肝癌细胞进行干预，结果显示氧化白藜芦醇可以通过抑制肝癌细胞的增殖来发挥抗癌作用，并且从划痕实验和Transwell侵袭实验中也发现，氧化白藜芦醇可以在一定程度上抑制肝癌细胞的转移。

自噬是细胞的一种自我保护机制，是为了维持细胞内稳态的一种蛋白质降解途径，目的是实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。p62作为一种支架和适配子蛋白，参与自噬-溶酶体系统蛋白降解过程，介导细胞选择性自噬等多种功能。自噬活动受到抑制时，p62蛋白不断累积。同时，有研究表明，30余种基因（autophagy-related gene, Atg）直接参与自噬的形成。其中Atg8在哺乳动物中称为LC3，在自噬泡的形成中不可或缺。LC3有两种形式：LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3II/I的大小和LC3II的升高或降低可以反映自噬水平的高低。通过Western Blot，我们发现氧化白藜芦醇组p62蛋白的表达明显增加，LC3蛋白的表达明显减少，结果具有显著性差异，表明氧化白藜芦醇的抗肿瘤作用与促进肝癌细胞自噬无关。氧化白藜芦醇可能通过抑制肝癌转移相关基因的表达，对肝癌的发生和转移起到抑制作用，从而改善肝脏组织的恶化。但是具体的机制还不是十分明确，尚需要进一步研究。

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