林蛙油冻干粉与原油对小鼠网状内皮系统的影响

王力勋1 杨大宇1 刘艳1 刘志茹2 张凤春2 杨炳友1 吕邵娃1*

（1.黑龙江中医药大学 黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室 哈尔滨 150060，2.哈尔滨四宝生物科技有限公司  铁力市 152500）

摘要:目的：探讨林蛙油冻干粉与林蛙油原油，对于小鼠的网状内皮系统对炭粒的廓清能力的作用差别。

方法：小鼠70只随机分组分为空白对照组、模型组、林蛙油冻干粉低剂量组、中剂量组、高剂量组、林蛙油原油组、阳性药组。空白对照组每天灌胃生理盐水 1 次，连续给药 7d。模型组每天灌胃生理盐水 1 次，模型组分别于实验第1、3、5天皮下注射环磷酰胺30mg/kg，林蛙油冻干粉低剂量组、中剂量组、高剂量组分别每天灌胃0.07g/kg、0.14g/kg、0.28g/kg林蛙油冻干粉泡发后溶液一次，林蛙油原油组每天灌胃林蛙油原油0.14g/kg一次，阳性对照组每天灌胃阳性药3.9g/kg一次，连续给药14d。尾静脉注射印度墨汁，后处死，取肝、脾、胸腺计算廓清率。结果：林蛙油冻干粉及原油都能提高小鼠炭粒廓清能力，林蛙油冻干粉能提高机体免疫力功能和抗应激能力并能明显提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，清除自由基，增强机体非特异性免疫功能。

关键词　林蛙油冻干粉、免疫力低下、网状内皮系统

Abstract

Abstract: objective: To investigate the effect of frostbite powder and crude oil on carbon granule clearance in mice reticuloendothelial system. Methods: Seventy mice were randomly divided into blank control group, model group, low dose group, medium dose group, high dose group, crude oil group and positive drug group.In the blank control group, normal saline was administered once a day for 7 days.Model group lavage saline 1 times a day, model roup, respectively in experiment 1, 3, 5 days subcutaneous injection cyclophosphamide 30 mg/kg, oviductus ranae producing low dose group, middle dose group, high dose group were to fill the stomach every day 0.07 g/kg, 0.14 g/kg, 0.28 g/kg oviductus ranae once, after producing bubble solution oviductus ranae oil group by gastric oviductus ranae 0.14 g/kg of crude oil every day at a time, positive control group by gastric positive medicine every day 3.9 g/kg at a time, continuous dosing 14 d.After injecting Indian ink into tail vein, the liver, spleen and thymus were taken to calculate the clearance rate. Results: Both frostbite oil and crude oil can improve the carbon clearance ability of mice. The frostbite oil can improve the body's immune function and anti-stress ability, and can significantly improve the phagocytic rate and phagocytic index of macrophages, scavenge free radicals, and enhance the body's non-specific immune function.

Keywords： oviductusranae lyophilized powder、 low immunity，、reticuloendothelial system

林蛙油为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，经采制干燥而得，也称蛤蟆油，是食、药两用的佳品，具有补肾益精，养阴润肺之功效。用于阴虚体弱，神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止、劳嗽咳血等症的治疗^[5]，收载于《中国药典》2015年版一部。林蛙油蛋白质含量丰富，粗蛋白含量高达 50%以上。目前，市售的林蛙油均按自然干燥方法获得，这种传统的干燥方法一方面不利于消化、吸收，另一方面这种加工方式周期长，易霉变。本文通过研究林蛙油及林蛙油冻干粉对免疫低下小鼠网状内皮系统吞噬廓清能力的影响，来探讨冷冻干燥和自然干燥所获得的林蛙油饮片在药理作用方面异同，为林蛙油冻干粉药材饮片的临床使用提供科研资料。

1. 实验部分

1.1 材料、仪器、动物

林蛙油冻干粉、林蛙油（黑龙江四宝生物科技股份有限公司提供）；贞芪扶正颗粒：批号170020，修正药业集团有限公司；印度墨汁（上海源叶生物科技有限公司）；生理盐水（哈尔滨三精制药）；环磷酰胺( CY) （江苏恒瑞制药有限公司，国药准字 H32020857）；乙醚（天津市巴斯夫化工有限公司）；生理盐水（哈尔滨三联药业股份有限公司）；甲醇、明胶、无水碳酸钠（天津市巴斯夫化工有限公司）。

真空冷冻干燥机GLZY-0.5B（上海浦东冷冻设备干燥厂）；LT1000B电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）；紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）； AB265-S分析电子天平(美国METTLER TOLEDO公司）；恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司。

KM小鼠，（批号：SCXK（京）2012-0001）购自黑龙江中医药大学药物安全性评价中心。

1.2 方法与结果

1.2.1实验动物分组与给药

取 KM 小鼠70只，18~22g，雌雄各半，将小鼠按体重随机分为正常对照组、免疫低下组、林蛙油冻干粉低剂量组、林蛙油冻干粉中剂量组、林蛙油冻干粉高剂量组、林蛙油原油组、贞芪扶正颗粒阳性药组，每组10只。

林蛙油冻干粉放入温水中3-5min会膨胀，10g林蛙油冻干粉会发泡700g左右，成人每天0.2~1g林蛙油干品。以成人剂量0.2~1g/人/天，以成人70 kg体重计算，计算该药小鼠的低剂量为0.07g/kg，中剂量为0.14g/kg，高剂量为0.28g/kg。给药组剂量:高剂量组为等效剂量的4倍，配成药液浓度为30%;中剂量组为等效剂量的2倍，配成药液浓度为15% ，林蛙油原油剂量为0.14g/kg。阳性对照组药：贞芪扶正颗粒为3.9g/kg。免疫力低下造模药：环磷酰胺30mg/kg。

1.2.2实验方法

空白对照组每天灌胃生理盐水 1 次，连续给药 7d。模型组每天灌胃生理盐水 1 次，环磷酰胺组分别于实验第1、3、5天皮下注射环磷酰胺30mg/kg，林蛙油冻干粉低剂量组、林蛙油冻干粉中剂量组、林蛙油冻干粉高剂量组分别每天灌胃0.07g/kg、0.14g/kg、0.28g/kg林蛙油冻干粉泡发后溶液一次，林蛙油原油组每天灌胃林蛙油原油0.14g/kg一次，阳性对照组每天灌胃贞芪扶正颗粒3.9g/kg一次，连续给药14d。于末次给药禁食24h后，按0.1 ml/10g 体质量尾静脉注射25%印度墨汁，印度墨汁溶于明胶溶液中，浓度为25%，注入后立即计时，并分别于第2，10 min时眼眶取血，用微量取样器( 预先用肝素浸润) 吸取 20μl，分别加入 2 ml 的 0.1% 碳酸钠溶液中，摇匀，在 600 nm 波长处测定 OD 值，2min血样为OD1，10min血样为OD2。采血后的小鼠处死取其肝、脾和胸腺，并称取肝和脾重量（精确至万分之一）。按下式计算廓清指数(K)及吞噬指数 (α)、脏器指数。

1.2.3实验结果

根据上述碳粒廓清实验得出以下数据，结果见表1

表1　林蛙油冻干粉对小鼠炭粒廓清能力的影响(±s; n=10)

注:与生理盐水组比*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较^△P<0.05，^△△P<0.01，与阳性药组比较^▽P<0.05，^▽▽P<0.01， 与林蛙油原油组比较^○P<0.05，^○○P<0.01，

与正常组比较，模型组吞噬指数、吞噬系数均有降低，具有显著性差异（P<0.01），说明造模成功，与模型组比较，冻干粉高、中、低剂量组、林蛙油原油组和阳性对照组的吞噬指数、吞噬系数均具有显著性差异（P<0.01），说明冻干粉高、中、低剂量组，林蛙油原油组，阳性对照组均具有提高机体非特异性免疫力的能力。与阳性药比较，冻干粉高剂量吞噬指数、吞噬系数均有所提高具有显著性差异（P<0.01），冻干粉中剂量组、林蛙油原油组吞噬指数、吞噬系数  无显著性差异（P＞0.05），林蛙油中剂量组、林蛙油原油组与阳性药组功效无明显差异，对提高非特异性免疫具有相似功效。冻干粉低剂量组吞噬指数、吞噬系数均降低，低剂量组也具有疗效，但低剂量组疗效不显著。与林蛙油原油比较，冻干粉高剂量组吞噬指数、吞噬系数均有所提高，具有显著性差异（P<0.01），高剂量组与林蛙油原油比较具有较好的疗效，与林蛙油原油组比较冻干粉中剂量组吞噬指数、吞噬系数无显著性差异（P＞0.05），林蛙油中剂量组与林蛙油原油组功效差距不明显。低剂量组也具有疗效，但与林蛙油组比较疗效不显著。林蛙油原油组与冻干粉中剂量组具有相同功效。且高剂量组与原油组比较疗效要高于原油组。

2 讨论

林蛙油作用的研究已受到国内外学者的极大重视。现代医学表明研究记载林蛙油具有延缓衰老，抗疲劳，滋阴养颜.其含丰富蛋白质，氨基酸，微量元素，维生素和矿物质，对机体的生长发育^[2]，延缓衰老和健康强壮诸方面都有较强的促进作用，提高机体免疫力功能和抗应激能力并能明显提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数^[3]，清除自由基,增强机体非特异性免疫功能和体液免疫功能，使人远离亚健康状态。

当炭粒经静脉注射进入血液循环，迅速被主要定居在肝和脾的巨噬细胞所吞噬和清除。若将碳粒的量恒定，从血流中消除的速率即廓清指数K（未经校正的吞噬指数），然而小鼠个体、肝脾差异使得廓清指数K不等，因此，在进行实验结果判断时，吞噬指数a值(又叫校正吞噬指数)的意义大于廓清指数K值，其代表了单位组织重量的吞噬活性，可反映单核巨噬系统的吞噬能力，是衡量机体非特异性免疫功能的标志^[4.5]。

本实验显示，林蛙油冻干粉可降低碳粒廓清指数K和吞噬系数α，抑制单核巨噬细胞的吞噬功能，林蛙油冻干粉具有提高小鼠网状内皮系统对炭粒的廓清能力，并且林蛙油冻干粉与林蛙油原油的效果无显著性差异。林蛙油冻干粉也可作为药材饮片于临床使用，并且冻干粉有利于林蛙油的消化吸收以及保存加工，降低成本和加工时长。

参考文献

[1]中国药典．一部[S]．2015：255

[2]张馨月，陈光，刘仁杰,王刚.林蛙油抗氧化组分筛选及水溶性蛋白抗氧化肽的制备[J].食品科技，2014,39(05):217-220.

[3]张馨月. 林蛙油抗氧化肽的制备及其抗氧化活性研究[D].吉林农业大学,2014.

[4]苏晔.胎盘免疫调节因子的生物学功能及临床应用进展[J].免疫学杂志,2002,18(B06):117 -119.

[5]梁积恒.胎盘免疫调节因子临床应用进展[J].广西医科大学学报,1997,14(1):148 -150.