长链非编码RNA在胃癌中的作用

刘国龙 马刚

胃肠肿瘤生物学研究室，天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心

天津医科大学肿瘤医院  300070

摘要

长链非编码RNA（long non-coding RNA  lncRNA ）是一种具有调节细胞生长、增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学功能的长度大于200 nt一类RNA分子。lncRNA作为癌基因或抑癌基因调控下游靶基因的表达，通过不同的分子机制在不同的肿瘤中发挥着重要作用。但lncRNA在胃癌中的具体作用机制尚不明确。本综述旨在通过总结与胃癌相关lncRNA的作用机制，为胃癌的诊断与治疗提供一种新的思路。

关键词  lncRNA   胃癌   诊断   治疗

Abstract

Long-stranded non-coding RNA is a kind of RNA molecule with biological functions such as regulating cell growth, proliferation, apoptosis, invasion and metastasis. LncRNA, as an oncogene or anti-oncogene, regulates the expression of downstream target genes and plays an important role in different tumors through different molecular mechanisms. However, the specific mechanism of lncRNA in gastric cancer is not clear. This review aims to provide a new idea for the diagnosis and treatment of gastric cancer by summarizing the mechanism of action of lncRNA related to gastric cancer.

Keywords:   gastric cancer   Diagnosis   treatment  

背景

胃癌是全世界排名第二的致死率较高的恶性肿瘤，对人们的健康有着严重威胁[1]。保守估计，全世界每年平均大约有将近750,000新增病例被诊断出来患有胃癌，而且其5年生存率不高于25%[2, 3]。虽然近年来胃癌患者5年生存率有所提高[4]，但由于缺乏典型的分子标志物进行早期诊断，缺乏有效的筛选程序和明显的早期症状，胃癌患者不易被检测出来，发现时已处于晚期，错过了最佳治疗时期。尽管给予胃癌患者以化疗、放疗或者手术治疗，但结果不胜利理想。近年来，诸多研究表明，长链非编码RNA(lncRNA)，在胃癌的发生发展过程中发挥着不可替代的作用，为胃癌的研究开辟了新的思路，对了解胃癌分子机制的形成、确认潜在的诊断和预后靶标、为其治疗提供更多有效的可能。

长链非编码RNA(lncRNA)是一种由外显子和内含子组成，没有明显的开放阅读框的功能性不编码蛋白质的RNA[5]。有研究表明，人体内大约有16000个基因共编码超过28000个lncRNA分子[6]。根据lncRNA与细胞内邻近蛋白编码基因的相对位置可分为五类：（1）正义lncRNA（2）反义lncRNA（3）双向lncRNA（4）基因间lncRNA（5）基因内lncRNA[7]。在过去的几十年里，人们主要致力于编码基因和基因组突变引发的胃癌发病机理的研究。曾一度认为非编码RNA是“转录噪音”、无功能的“垃圾序列”[8, 9]。但近年来的诸多研究表明lncRNA存在并呈现出高度组织和细胞特异性方式，广泛参与众多疾病的病理和生理过程[10]，并且涉及转录调控、细胞分化、个体发育等重要的生命调控过程[11-13]。

许多研究指出lncRNA不论在正常还是病变的生物学进程中都发挥着重要的作用。尤其在基因的表达调控过程中起着关键性作用，在胃癌中的异常表达从细胞增殖、凋亡、转移以及基因组稳定性等方面影响着细胞的内稳态。在本综述中主要描述lncRNA在胃癌中的作用以及lncRNA作为胃癌临床诊断靶标和胃癌诊断标志物的潜在价值，同时介绍其研究方法并讨论通过测序技术来发现相关的主要基因，为治疗胃癌尽可能提供一种新的方法。

胃癌中的lncRNA及其表达特征

胃癌的形成是一个复杂且多步骤的过程，涉及诸多遗传和表观遗传的改变。有研究指出许多lncRNA具有显著的二级结构，而这一点对其特异性的绑定和功能是非常重要的。lncRNA在蛋白的相互作用中起诱饵、活化、引导或者支架的作用[14]。而这些作用与lncRNA的突变和失调有关，这种变化可作为疾病诊断的标志物和潜在的药物靶点。对于开发新型的治疗方案具有重要作用。随着lncRNA诸多功能的发现，人们对其在癌症的发生和进程中发挥的重要作用越来越了解[15]。人们第一次对lncRNA在胃癌中作用的了解来源于Feng和其同事对胃癌中H19的研究[16, 17]。从而揭示了lncRNA与胃癌之间的联系。继这项研究后，对于lncRNA在胃癌中异常表达的研究逐渐增多。许多研究表明特异的lncRNA在胃癌中具有潜在生物和临床关联性。其中，一些lncRNA 起致癌作用或抑癌基因的作用直接参与在肿瘤形成和发展的过程，比如，EMT过程。其他一些lncRNA 通过调节分子（如：DNA、RNA、蛋白质）的相互作用在肿瘤的恶性转化中发挥着重要的作用[18]。下面我们讨论一些具体lncRNA 在胃癌中的作用[15]以及一些lncRNA异常调节的机制[19]。

H19

H19基因编码一段长2.3kb的lncRNA，属于高度保守基因簇，在胚胎的形成和发育过程中有着重要的作用[20, 21]。Feng等[22]，首次阐明了H19在胃癌作用。H19的表达水平在胃癌细胞系和胃癌组织中显著增高。H19基因沉默能抑制细胞增殖，而其异常表达有助于胃癌AGS细胞凋亡。从机理方面来说H19和P53有关，导致部分P53失活并抑制凋亡。最近，发现参与胃癌发展和进程的lncRNA-H19的异常表达，通过外源c-Myc诱导以调节细胞增殖[23] 。Zhuang和Li的团队表明H19及其成熟产物miR-675在胃癌的致癌过程包括增殖、迁移、侵袭和转移中发挥着至关重要的作用。该团队也证明RUNX1介导的H19 / miR-67诱导胃癌细胞的表型变化和H19 / miR-675 / RUNX1新途径可作为胃癌的潜在治疗靶标[24, 25]。

HOTAIR

lncRNA-HOTAIR最初是由Rinn等在2007年发现。在组织中特异表达，同时其也认为在引导和支架原型中起作用[26, 27]。HOTAIR招募PRC2下调HOXA10等靶基因转录，导致细胞命运的变化。另一方面，HOTAIR可作为支架，通过提供结合表面以组装一些组蛋白修饰酶（如：PRC2、LSDI），从而说明靶基因上组蛋白的修饰模式[28]。有研究发现胃癌中有HOTAIR的存在[29-31]。胃癌中，HOTAIR在癌组织中的表达水平高于其邻近非癌组织，并且高度表达的HOTAIR于淋巴结转移和肿瘤分期（TNM）显著相关[32]。体外研究表明，胃癌细胞中HOTAIR的抑制作用可逆转EMT过程并通过MMP1和MMP3的下调降低侵袭力[29]。不久之后，Hajjari展示了同样的现象并且发现在胃癌中HOTAIR的表达水平与SUZ12的表达水平有相关性[32]，意味着HOTAIR在胃癌的发展中有多方面的机制。尤其是，Liu等发现HOTAIR可作为ceRNA并通过靶向miR-331-3P有效的抑制HER2的表达，这一点在晚期胃癌中有显著的表现[31]。

ANRIL 与 FENDRR

LncRNA-ANRIL与FENDRR在一些研究中指出其在胃癌中起支架作用[33, 34]。在Er-bao Zhang的实验室中发现，胃癌组织中高度表达的ANRIL与高TNM分期和肿瘤大小显著相关，并且可作为整体存活的独立预测因子。此外，ANRIL介导的促进生长部分是由miR-99a / miR-449a通过E2F1诱导与PRC2和ANRIL结合形成反式表观遗传阻遏，从而形成正反馈环以促进胃癌细胞的增殖[33]。但是，FENDRR在胃癌细胞系及癌症组织中表达下调。FENDER过表达通过下调FN1和MMP2 / MMP9抑制胃癌细胞的体外侵袭和迁移，而胃癌细胞中FENDER的低表达受组蛋白脱乙酰化调节[34]。

Gas5

LncRNA-Gas5 作为诱饵原型在CRC、乳腺癌、HCC、肾癌等癌症中起肿瘤抑制因子的作用[35-39]。最近证实，Gas5可作为不良预后的新标志物和胃癌介入治疗的潜在靶点。Gas5在胃癌组织中表达显著下调并与较大肿瘤块及晚期病理分期相关。Gas5低表达水平的患者具有较差的无病存活率，总体生存率高于那些具有Gas5高度表达的病人。再者，GAS5的过表达导致胃癌细胞增殖的减少，并调节E2F1和P21的表达[40]。

HULC 与 MEGC3

Zhao[41]等研究表明，HULC在胃癌细胞系和组织中显著高表达，并且其高表达与淋巴结转移，远转移，晚期淋巴结转移分期有相关性。敲掉胃癌SGC7901细胞中的HULC能够抑制细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡。而HULC的过表达具有相反的作用。他们也证实了HULC的高度表达能够诱导SGC7901细胞发生自噬，从而促进细胞凋亡。

   Sun[42]等研究发现，MEGC3在胃癌的形成和发展过程中具有生物学作用和临床意义。与正常组织相比，MEGC3在胃癌组织中的表达水平显著降低，并且其表达水平与TNM分期、深度侵袭及肿瘤大小高度相关。再者，MEGC3的过表达能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，并调节胃癌细胞中P53的表达。敲掉MEGC3能促进细胞增殖。

胃癌中的其他lncRNA

Feng[43]等研究发现，CCAT1的表达水平在胃癌组织中显著增加，CCAT1是由c-Myc直接与其启动区E-box元件结合而激活。另外，CCAT1的异常表达促进AGS细胞的增殖和迁移。这些数据表明c-Myc对CCAT1的诱导在胃癌中具有重要的作用，同时也意味着CCAT1在胃癌治疗应用中的潜在可能性。

有研究首次发现，lncRNA-GHET1 在胃癌中表达上调,并且其过表达与肿瘤大小、肿瘤侵袭、不良生存率有关[44]。在体内或体外试验中，GHET1过表达都能促进胃癌细胞增殖，若敲掉GHET1就能抑制细胞增殖。从机理上来说，GHET1与IGF2BP1相互关联，能增强c-Myc mRNA与IGF2BP1的相互作用，最终增强c-Myc mRNA的稳定性和表达量，并促进胃癌细胞的增殖。这些研究发现表明GHET1对胃癌治疗和预后的潜在有用性[44]。一项新的研究发现,GACAT1可能是胃癌诊断的靶点[45, 46]，其在胃癌组织中下调表达。其表达水平与淋巴结转移，远距离转移和肿瘤淋巴转移分期及分化高度相关。同时，lncRNA-HMlincRNA717 and AC130710也被称作GACAT2 和GACAT3。尤其是，在胃癌的复发和发展过程中起着重要的作用，也被认为是胃癌诊断的潜在靶点[47-49]。近年来，许多不同的 lncRNAs 在胃癌中被发现，它们具有上调或下调或其他重要的作用。Park等通过 RNA-seq 测序发现lncRNA-BM742401 在胃癌组织中表达下降，并且BM742401的异位过表达能抑制转移相关表型并降低细胞外MMP9的浓度[50]。另外，发现不久的lncRNA-FER1L4 和 AC138128.1在胃癌组织及细胞中具有下调作用[51-53]。然而，低表达水平的FER1L4与肿瘤、病理分期、一般分类、淋巴结转移、远转移、TNM分期、血管或神经分期以及血清中CA72-4的含量有关[51]。但是，AC138128.1的表达水平与胃癌的临床病理特征并没有显著的关联性[52]。

lncRNA与临床

lncRNA与诊断

肿瘤患者外周血中稳定存在的蛋白和核酸分子可以作为标志物用于临床诊疗。而身为其中一员的LncRNA广泛存在于外周血及单核细胞中。已有研究表明LncRNA可以用于诊断胃癌的有力证据[54-56]。例如：胃癌患者血浆中H19的表达水平明显高于健康人体的表达水平，并在手术后其表达水平也显著降低[57]，这也表明在在血浆中检测到的循环H19 可以提供新的肿瘤互补标记物。

    近来，在胃液中发现的lncRNA可作为胃癌筛选的肿瘤标志物。Shao[58]等研究表明，lncRNA-AA174084 在大多数胃癌组织样品中下调表达，但在胃癌患者胃液中呈现过表达状态。lncRNA-AA174084的表达水平与病人的年龄、Borrmann 分型、侵袭、淋巴结转移高度相关。这也意味着lncRNA-AA174084可作为胃癌早期的诊断标志物。也有研究表明lncRNA-LINC00152[59]在一些胃癌细胞中过表达[60, 61]。Zhao[61]等，在HGC-27和SGC-7901细胞中用siRNAs干扰LINC00152的表达，分析发现，该敲除能有效的抑制细胞增殖、集落形成、并促进细胞周期停止在G1期、促发晚期凋亡、减少EMT程序、抑制细胞迁移和侵袭。这些证据表明LINC00152在胃癌中有致癌靶点，因此，可能是胃癌治疗的潜在靶点。同时也是胃癌中胃液及血液中的一个诊断靶点[59]。Li等研究发现，晚期胃癌患者血液中LINC00152的表达水平明显高于早起胃癌患者和正常人群。这些发现表明LINC00152可作为一个基于血液进行胃癌诊断的新的标志物。相反地，lncRNA-AI36471在胃癌中明显表达下调，并与胃癌大小和分化密切相关，这表明AI364715可作为胃癌诊断的潜在生物标志物[62]。同样的，lncRNA-HMlincRNA717在胃癌中表达下调，其表达水平与癌的远端转移、静脉侵袭、神经侵袭等高度相关，表明这种lncRNA 参与肿瘤的形成和发展，同时也是早期胃癌诊断的潜在的新的标志物[47]。还有其他一些在胃癌患者血清中异常表达的lncRNA，包括lncRNA-CUDR、LSINCT-5、PTENP1等，以及胃液中lncRNA-UCA1和ABHD11-AS1等为以lncRNA作为潜在诊断标志物进行筛选胃癌提供了支撑[63-65]。

lncRNA与治疗

一些lncRNAs由于参与了引起胃癌形成的生物学过程，可认为其为胃癌的的潜在治疗靶点。以ANRIL为例：它在人类胃癌组织及一些胃癌细胞系中高表达，并且与TNM分期、肿瘤大小有紧密的相关性，被认为它是总生存率的一个独立检测物。通过转染实验，不论是在体内还是体外实验中，ANRIL的siRNA在SGC-7901和BGC-823细胞系中都能明显的抑制细胞增殖。这项研究同时也表明，E2F1能诱导ANRIL表达，而这些表达的ANRIL通过与PRC2结合，能使miR-99a或miR-449a的表型沉默。这两种miRNAs能够抑制mTOR和CDK6或E2F1信号通路的活化，ANRIL通过胃癌中正反馈调节间接的诱导细胞增殖，因此其可作为人类胃癌治疗的长期的潜在的新的靶点[66]。另一种lncRNA-AK058003，被认为是胃癌中低氧和转移的监测器，它在胃癌组织中普遍上调，在体内和体外实验中，通过调控与转移相关的基因SNGC的表达来促进胃癌的迁移和侵袭。在AK058003细胞系中，发现基因SNGC在其CpG岛中高度甲基化。这些结果说明了AK058003是怎样精确的监测低氧信号，并成为有用的治疗新靶点[67]。相似的，lncRNA-SPRY4基因内含子转录本1（SPRY4-IT1）在胃癌组织及细胞系中显著增高，而且与肿瘤大小、侵袭深度、远距离转移、TNM分期成高度正相关性，并降低总生存率和无病生存率。另外，体外分析表明SPRY4-IT1在MKN45细胞中能显著抑制并降低细胞增殖，群体形成、细胞迁移或侵袭。这样的结果是由周期蛋白和基质金属蛋白酶有关的基因共同调节管理作用下形成的，这也意味着SPRY4-IT1胃癌形成中是必不可少的，同时也是胃癌治疗的一个新靶点[68]。相反的，Xie[69]等研究发现，这种lncRNA在胃癌中有下调作用，其低表达涉及到胃癌的形成进展与转移。

lncRNA与预后

诸多研究论证了lncRNA的异常调节与胃癌和预后的关系。lncRNA的表达水平可对疾病的结果进行预测。例如，一些lncRNAs（如：HOTAIR 和GHET1）在胃癌组织中高表达，在非癌组织中表达水平较低。另外，病人体内这些lncRNA高度表达时，他们将会有不良的总生存率[29, 44]。

lincRNA-LINC00152[59]，研究发现其在胃癌及相关的临床中都有异常表达。LINC00152在胃癌及胃癌细胞系中表达水平都显著高于正常人体。母本表达基因3（MEG3）的表达水平与肿瘤形成有关[70]，是一种肿瘤抑制lncRNA[71]。在胃癌中降表达，导致不良预后。最主要的是，miRs能与MEG3相互作用并调节其表达。MEG3在胃癌中高甲基化，miR-148a的抑制作用可调节DNA甲基转移酶1（DNMT-1），并使MEG3在胃癌中下调[72]，可通过调节miRs来提高胃癌患者的预后。Rinn[27]等发现的lncRNA-HOTAIR,在胃癌中过表达，在体外可促进胃癌细胞的增殖，迁移，侵袭和静脉入侵，在体内一般促进淋巴结转移。因此，HOTAIR可导致胃癌得恶性表型并能作为胃癌不良预后的标志物[30, 73]。BM742401低表达的胃癌患者有着极差的生存能力[50]。这些研究结果表明单个lncRNA或者族群lncRNA可用于疾病结果的预测。

胃癌中lncRNA 的研究方法

有研究表明，通过二代测序技术能够发现胃癌中的一些癌症驱动基因。通过对胃癌进行全外显子测序，发现了染色体重组基因ARID1A突变以及钙粘蛋白基因家族中FAT4的突变，全基因组测序和全转录本测序在胃癌中也发现了新的突变[74]。使用二代测序技术系统性分析胃癌中的基因突变是一种有效的方式，同时对于胃癌发病机理的研究、确认新的治疗靶点以及有显著作用的生物标志物也有巨大潜力。与mRNA和其他类型的非编码RNA相比，LncRNA 的研究是一项具有挑战性的工作，需要更多可用于二代测序的序列进行充分说明。本文简单描述几种截止到目前最有代表性且常被运用于研究的几种计算工具[75-77]。

Sun和其同事[78]，通过测序途径，利用可靠性很强的软件检测新的lncRNA ,并将其称为lncRScan。RNA测序技术能够解决lncRNA 研究中所碰到的主要技术问题：排除有偏颇的转录本和人工合成的转录组。从复杂的组装程序中找出lncRNA ，并使其与具有编码蛋白功能的mRNA相区别。在质量控制后，其他组件作为lncRScan 输入用于新型lncRNA 的检测。

近来，Sorep等[79]综合全面的描述了lncRNA在RNA测序分析中的具体流程。这种方法是基于样品特定数据库的建立，能够分析统计源于一些检测平台和映射分析方法所得的RNA测序数据。在通过映射法读取序列数据后，发现它们的基因组坐标与那些用于重建lncRNA转录物模型的最大可用数据库是有交集的，如GENECODE[80]。在适当的筛选之后，使用Bioconductor edgeR进行检测lncRNA候选物的差异表达，Bioconductor edgeR[81]是一种能考虑生物学和技术变异性以及调节跨转录物的过度分散的程度的分包软件，从而能提高结果的可靠性。

Musacchia等[82] 对于重新生成的转录本的研究，提供了一种管道相结合的识别编码和长非编码RNA的鉴定的管道，但没有比较数据的支持。Annocript通过杠杆作用对特定lncRNA的识别主要是基于公共注释数据库和测序分析软件对其蛋白或者结构域相似性、长的开放阅读框和高非编码潜力的确认。最近，Jiang[83]提供了一种研究lncRNA功能的新方法。LncRNA2Function提供第一本体驱动用户友好网站系统是基于多条件下的相似表达模式可能具有相似的功能和生物通路。该工具功能性的注释着单个或者一组有功能地位的lncRNA与特定编码蛋白基因共同表达的lncRNA有着显著的相关性。因此，通过Pearson相关系数对所有lncRNA-mRNA基因对在计算之后进行标准作图和装配，为每个lncRNA分配一组显着共同表达的蛋白质编码基因，其为lncRNA提供了有显着富集这种蛋白质的功能和注释途径。因而，该工具可以浏览源于19个人正常组织的RNA-seq数据，进而可以检索与特定功能有关的lncRNA ,这些特定的功能对单个lncRNA或者有指定功能的lncRNA的作用的研究提供了宝贵的资源。

结论

在世界范围内，胃癌是癌症相关引起死亡的主要原因之一，对进行肿瘤预防和诊断而确认潜在的分子有很大的临床研究价值。近年来，诸多研究表明，一些lncRNA在胃癌中失调，并与肿瘤形成、转移、预后密切相关。这些属于调节性ncRNA的lncRNA，参与了诸多生物学过程并与许多疾病及癌症有关。

  尽管，这类新颖的异常表达分子在未来的临床应用中非常有价值，但在其作为胃癌临床诊断标志物之前，我们还有一段很长的路要走。首先，虽然整个基因组中大约有98%属于非蛋白编码基因，但仍然不清楚其中lncRNA到底占有多大的比例。其次，目前筛选lncRNA有诸如RT-PCR、lncRNAs芯片、二代测序等方法。但简单而更实际的技术对于筛选和确认与疾病相关的lncRNA将会更有用。再者，尽管证实了lncRNA涉及胃癌的每个阶段，包括起始、发展、迁移、侵袭以及转移，但它们的生物学机制并不完全清楚。另外，我们需要更有力的证据来阐明lncRNA的调控作用，通过构建交互网络或者经典信号通路来评估它们的功能。lncRNA成为胃癌临床标志物的最大障碍就是缺乏更多具有特异性和灵敏性的lncRNA以及相应的临床检测技术。因此，为筛选胃癌新的分子标志物而提供更好的诊断和预后工具是必不可少的。以lncRNA作为临床标志物可能有助于病人管理，比如，胃癌的诊断、分类、预后评估等。在过去的许多年里由于人们更多的关注PCG蛋白而低估了lncRNA的作用。然而，尽管目前lncRNA在胃癌诊断、治疗及预后方面还存在很多困难，但在不久的将来，基于lncRNA的研究领域毫无疑问将会热门，并将不断促进对胃癌理想标志物和靶点治疗的研究。

展望

随着高通量测序技术而涌现的数据为理解与胃癌相关的分子分类、细胞内途径提供了有价值的信息。近年来，lncRNA在许多领域引起了人们的广泛关注，旨在了解多种细胞的过程，尤其是了解癌症中由于其的弱调控作用而导致的恶性肿瘤的形成。研究发现，大量的lncRNA对癌症表型的转化和维持有着重要的临床意义，为癌症的诊断和治疗提供了很大的新的可能。在本文中，lncRNA的一个最显著也最重要的特征是在组织和细胞的高度表达模式使其可作为癌症诊断的精确标志物或者癌症治疗的治疗靶标。

就诊断而言，癌症特异性中的一些lncRNA可从癌症患者的组织、血浆、尿、胃液中可检测到。在一些案例中，这些lncRNA在一些小样品中比传统的胃癌标志物，如，CEA和CA19.9更加准确[45, 84]。

  就治疗而言，当前研究主要侧重于理解lncRNA的功能影响，尤其是其在mRNA、miRNA以及蛋白活性方面的特异调控作用。由于lncRNA能调控蛋白活性，lncRNA作为药物靶点比传统的药物蛋白靶点更准确和低毒性。通过基于RNA（如siRNA和microRNA）的治疗措施，或者使用特异性设计的小分子化合物与靶lncRNA或者核糖核蛋白复合物共同作用而获得潜在的益处[85]。参与细胞调节过程的成千上万的lncRNA的存在对我们所了解的癌症有重要的意义。并促进研究人对当前的疾病的概念从其病因起源到治疗设计和处方的修订。综上所述，lncRNA在胃癌致癌作用中发挥着多方面的作用，也可能将是一种新颖胃癌诊断和预后标志物，同时也将会是一种有效的胃癌治疗靶点。

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作者简介及联系方式

刘国龙 目前就读于天津医科大学，是硕士研究生，在天津医科大学肿瘤医院胃肠肿瘤生物学研究室从事泛素化修饰与胃肠肿瘤相关研究。

地址：天津市和平区气象台路22号，天津医科大学

邮编：300070