梳状聚苯乙烯环氧载体的制备及其对Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶的柔性固定化

周蕊¹ 张丽倩¹  潘鸣歧²

 (陕西国际商贸学院学院，陕西 咸阳 712046，无锡市环境检测中心站，无锡 江苏 214000)

摘要：以氯磺化交联聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-SO₂Cl)微球为基质，依次与壳聚糖(Chitosan，简写为Chi)和环氧氯丙烷(ECH)反应，制得了具有柔性链的梳状聚苯乙烯环氧载体PS-SO₂-Chi-ECH，研究了缚酸剂种类和用量、反应时间、反应温度及ECH用量对载体制备的影响。结果表明：当NaCO₃作缚酸剂、壳聚糖树脂与NaCO₃和ECH摩尔比为1:5:5，反应时间2h，反应温度50℃为宜。将该聚苯乙烯环氧载体用于Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶的共价柔性固定化，其稳定性较游离酶得到明显提高。

关键词：氯磺化交联聚苯乙烯-二乙烯基苯; 壳聚糖; 聚苯乙烯环氧载体; 柔性固定化; Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶

Preparation of Hydrophilic and Comblike Polymer Support Containing Epoxy Group for Flexible Immobilition of Pseudomonas aeruginosa LX1 Lipase

ZHOU Rui¹  ZHANG Li-Qian  PAN Ming-qi²,

(Shaanxi Institute of International Trade&Commerce, Shaanxi,

Wuxi Environmental Monitoring Center Station, Wuxi)

Abstract: With chloro sulfonated crosslinked polystyrene-divinyl benzene (PS-SO₂Cl) microspheres as substrate, followed with chitosan (Chitosan, abbreviated as Chi) and epichlorohydrin (ECH) reaction, comblike polystyrene epoxy resin PS-SO₂-Chi-ECH was prepared with flexible chain. Effects of acid binding agent type and amount , reaction time , reaction temperature and  ECH dosage on the carrier prepared. The results show that: when NaCO₃ acid binding agent, chitosan resin and NaCO₃ and ECH molar ratio of 1:5:5, reaction time 2h, reaction temperature 50 ℃. Lipase (Pseudomonas aeruginosa LX1) was immobilized on PS-SO₂-chi-Ech flexible support., its stability than the free enzyme has been improved obviously.

Key words: Chloro sulfonated crosslinked polystyrene-divinyl benzene; Chitosan; Polystyrene epoxy carrier; Flexible immobilization; Pseudomonas aeruginosa LX1 Lipase

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶)能够在油-水界面催化酯合成、酯交换、酯水解或醇解等反应，是目前使用较为广泛的商品化酶^[1]。然而，由于游离的脂肪酶在高温、强酸、强碱和有机溶剂等条件下，容易丧失活性，且存在不易回收、难以实现连续操作等缺点，导致生产成本提高。固定化酶可以克服游离酶的上述不足，同时保持了其催化特性，因此得到了广泛的应用^[2]。

固定化酶载体种类繁多^[3-8]，其中环氧载体因其含有的环氧基团可在温和条件下开环与酶分子中的胺基反应形成共价键，实现酶的固定化，此方法不需活化，操作简便，酶分子不易脱落，且固定化过程中对酶分子所产生的刺激也很小，因而十分适用于工业化固定化酶的生产^[9]。

“酶的柔性固定化”^[9-11]是指在固定化载体上接上一些足够长度的亲水分子链，即“柔性链”，然后再将酶键合到柔性链上。该柔性链可使载体表面的刚性及疏水性得到改善而变得柔顺、亲水，减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象^[12]，从而减少酶活的损失；同时被固定的酶仍有较高的自由度，可以较好地保留其游离态的均相催化活性。Gupta等^[13]通过聚乙烯醇 (PVA)改性聚丙烯膜，再经醛基化后获得了柔性固定化载体，并用于固定化脂肪酶，结果表明，该载体通过化学键合所固定的脂肪酶比聚丙烯膜吸附的脂肪酶具有更高的酶活力、稳定性及催化性能。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，属多糖类，不仅具有易得、易降解、无毒等优点，而且分子中大量的胺基和羟基对蛋白具有较好的亲和力，同时也可进行多种修饰、衍生化。因此本文以氯磺化交联聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-SO₂Cl)微球为基质，依次与具有柔性功能的壳聚糖(Chitosan，简写为Chi)和含有反应性的环氧氯丙烷(ECH)反应，合成梳状聚苯乙烯环氧载体(PS-SO₂-Chi-ECH，见图1)，并将其用于酶的柔性固定化。

图1 PS-SO₂-Chi-ECH合成示意图

Fig.1 Synthesis of PS-SO₂-Chi-ECH

1．材料与方法

1.1仪器与试剂

Nexus 870 型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，美国Nicolet；酶标仪(Power Wave XS，美国BIO-TECH公司；电子天平，JA2003，上海精密科学仪器有限公司；恒温振荡仪，THZ-82，常州国华电器有限公司 。

PS-SO₂Cl(交联度7%，200~260μm)由南京工业大学刘晓宁教授课题组提供，制备方法见文献^[14]；Pseudomonas aeruginosa LX1脂肪酶液(酶活90U/ml)，南京工业大学何冰芳教授发酵组提供；对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)，购自美国SIGMA公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2PS-SO₂-Chi-ECH的制备

壳聚糖树脂的制备：称取0.4g壳聚糖溶于10mL稀盐酸(wt=1%)，再称取PS-SO₂Cl树脂1g于三口烧瓶中，加入上述壳聚糖稀盐酸溶液，60℃反应24h，反应结束后用稀盐酸清洗树脂，再用去离子水清洗树脂至中性，最后用甲醇清洗3次后，于30℃真空干燥至恒重，得壳聚糖树脂PS-SO₂-Chi，其原料树脂增重率DW=106.63%。 

PS-SO₂-Chi-ECH的制备：制备方法按文献^[15]进行。将上述PS-SO₂-Chi树脂、ECH和缚酸剂按一定比例加入到三口烧瓶中，再加入3mL乙醇，于一定温度下反应一段时间后，所得产物用去离子水洗滤多次至中性，再用甲醇洗滤3-5次后，于30℃真空干燥至恒重，得PS-SO₂-Chi-ECH。

1.3 PS-SO₂-Chi-ECH的表征

PS-SO₂-Chi-ECH的红外吸收光谱(FT-IR)由美国Nicolet Nexus 870型红外光谱仪测定，扫描范围4000~400 cm^-1，采用KBr压片。

1.4固定化酶的制备

称取10 mg PS-SO₂-Chi-ECH载体于三角瓶中，加入含有100μl LX1脂肪酶液的磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.0)10 ml，37℃下反应4h。反应结束后，滤去脂肪酶液，用磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.0)清洗固定化酶，直到洗液中不含蛋白为止。

1.5酶水解活力的测定

采用pNPP法^[16]测定脂肪酶的活性。底物溶液C液为：A液(10.61 mmol/L的pNPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)的异丙醇溶液)与B液(0.1%(w/V)阿拉伯树胶和0.6%(V/V)Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.0)按体积比1:9混合制得。

将10mg固定化酶或稀释100倍的游离酶10μl加到配制好的底物溶液中(固定化酶所用底物溶液为10ml，游离酶为240μl)，于一定温度反应10min(游离酶酶活测定直接在酶标仪中反应)后，在λ=410 nm处利用酶标仪(Power Wave XS，美国BIO-TECH公司)测定反应生成的对硝基苯酚(pNP)的量。以每分钟产生1 μmol pNP 所需的酶量为一个酶活力(U)单位。文中固定化酶的酶活以载体的干重计算。

1.6 酶的热稳定性

将游离酶或固定化酶于不同温度的磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.0)中保育1h后测定酶活。定义最高酶活为100%。

1.7固定化酶的贮藏稳定性

    将游离酶于固定化酶于磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH=7.0)中，于4℃冰箱存放，定时测定酶活。定义初始酶活为100%。

2．结果与讨论

2.1 PS-SO₂-Chi-ECH的红外光谱分析

图2为PS-SO₂Cl 、PS-SO₂-Chi和PS-SO₂-Chi-ECH的FT-IR谱。可以看出，与a相比，b在1100cm^-1 处出现C-N伸缩振动吸收峰，1215cm^-1处；c在910cm^-1处出现环氧基吸收峰，加之反应经洗滤、干燥后，原料树脂有高达106.6%增重率。由此可见，ECH已发生了接枝反应。

图2 PS-SO₂Cl（a）、PS-SO₂-Chi（b）和PS-SO₂-Chi-ECH（c）的FT-IR谱

Fig.2 IR spectra of PS-SO₂Cl（a）、PS-SO₂-Chi（b）and PS-SO₂-Chi-ECH（c）

2.2 缚酸剂用量对反应的影响

以NaOH溶液为缚酸剂，考察了缚酸剂用量对PS-SO₂-Chi-ECH载体增重率和环氧基担载量的影响，结果示于图3。

图3 缚酸剂用量对反应结果的影响

Fig.3 Effect of deacid reagent on reaction result 

[PS-SO₂-Chi:ECH(mol/mol)=1:15; T=50℃; t=2h]

由图3可见，随着NaOH与ECH摩尔比的逐渐升高，载体增重率和环氧基担载量都先升后降，当比例为1:1时，载体增重率和环氧基担载量达到最高，分别为12.3%，1.82mmol/g。分析原因为，当NaOH加入量较少时，不能有效中和反应生成的HCl，其阻碍了反应的正常进行，从而使反应增重率降低；而NaOH加入量过多，ECH会在碱性条件下水解生成缩水甘油^[17]，使得与PS-SO₂-Chi发生反应的ECH的量相对减少，导致反应增重率降低。因此选择缚酸剂与ECH的摩尔比为1:1为最优比。

2.3 缚酸剂种类对反应的影响

以NaHCO₃、NaOH和Na₂CO₃溶液为缚酸剂，考察了缚酸剂种类对PS-SO₂-Chi-ECH载体增重率和环氧基担载量的影响，结果示于表1。

表1 缚酸剂种类对反应结果的影响

Tab 1 Effect of deacid reagent kind on reaction result

[PS-SO₂-Chi:deacid reagent:ECH(mol/mol)=1:15:15; T=50℃; t=2h]

由表1可见，使用NaOH和Na₂CO₃作缚酸剂时，载体增重率和环氧基担载量相比NaHCO₃作缚酸剂时分别提高了132.1%和175.5%，原因可能同2.2所述， NaHCO₃碱性相对较弱，与HCl反应的速率较慢，短时间内无法有效中和反应产生的HCl，过量的HCl可能会阻碍反应的正常进行，从而使反应增重率降低；而氢氧化钠作缚酸剂时，虽可有效中和HCl，但较强的碱性也会造成局部过碱现象，令ECH水解生成缩水甘油，使得与PS-SO₂-Chi发生反应的ECH量相对减少，导致反应增重率降低。因此选用Na₂CO₃作为最佳缚酸剂。

2.4 反应时间对反应的影响

考察了反应时间对PS-SO₂-Chi-ECH载体增重率和环氧基担载量的影响，结果示于图4。

图4 反应时间对反应结果的影响

Fig.4 Effect of react time on reaction result

[PS-SO₂-Chi:Na₂CO₃:ECH(mol/mol/mol)=1:15:15; T=50℃; t=2h]

由图4可见，随着反应时间的延长，载体增重率及环氧基担载量逐渐上升，至2h时基本达到最高；进一步延长时间反应时间，两者升高不明显，这说明反应时间为2h时，PS-SO₂-Chi上的胺基已基本反应完全。因此该反应的时间为2h较为合适。

2.5 反应温度对反应的影响

考察了反应温度对PS-SO₂-Chi-ECH载体增重率和环氧基担载量的影响，结果示于图5。

图5 反应温度对反应结果的影响

Fig.5 Effect of react temperature on reaction result

[PS-SO₂-Chi:Na₂CO₃:ECH(mol/mol/mol)=1:15:15; T=50℃; t=2h]

由图5可见，随着温度升高，载体增重率和环氧基担载量都为先升后降，在50℃时，增重率和担载量达到最高，分别为13.5%和2.08mmol/g。原因可能为，温度升高虽有利于ECH的接枝，但温度过高，也会使ECH发生副反应的速率变快。因此本文选用反应温度50℃为最优化反应温度。

2.6 投料比对反应的影响

本实验考察了ECH与PS-SO₂-Chi投料比对PS-SO₂-Chi-ECH载体增重率和环氧基担载量的影响，结果示于图6。

图6 x对反应结果的影响

Fig.6 Effect of x on reaction result

[x为ECH:PS-SO₂-Chi(mol/mol); Na₂CO₃:ECH(mol/mol)=1:1; T=50℃; t=2h]

  由图6可见，随着ECH加入量的增多，载体增重率和环氧基担载量为先升高，在ECH与PS-SO₂-Chi投料比为5:1时，增重率和环氧基担载量基本达到最高，继续增多ECH加入量，两者升高不明显。这说明投料比为5:1时，环氧氯丙烷的用量已能使壳聚糖树脂充分反应。考虑到环氧氯丙烷和壳聚糖树脂成本问题，投料比5:1可作为最优比例。

2.7酶的热稳定性

游离酶与固定化酶在相同保育时间(1h)不同保育温度的热稳定性结果示于图7。

图7 游离酶与固定化酶的热稳定性

Fig.7 Thermal stability of free and immobilized lipase

由图7可见，在保育温度30~50℃范围内，固定化酶和游离酶酶活都随着温度的升高而有所下降，两者稳定性基本相同。而60℃时，固定化酶在保育1h后仍保留47.4%的酶活，此时游离酶仅为10.0%。这可能由于柔性载体在固定化过程中，可有效维持酶分子的构象，同时也可稳定酶的构象，提高其耐热性。

2.8 固定化酶贮藏稳定性

固定化酶的贮藏稳定性在很大程度上反映了固定化载体的性能，固定化酶的贮藏稳定性见表2。

表2 固定化酶的贮藏稳定性

Tab 2 Storage stability of immobilized lipase

由表2可见，游离酶贮藏90d时其保留酶活为50.0%，已达半衰期；而固定化酶150d时，仍能保留初始酶活的81.9%。可见，该柔性梳状环氧聚合物载体固定化酶比游离酶具有更好的贮藏稳定性。

3.结论

梳状环氧聚合物载体PS-SO₂-Chi-ECH，由于其既存在可与酶键合的环氧基团，又有亲水性的壳聚糖柔性链，因而在固定化过程中有利于维持LX1脂肪酶蛋白的正常构象，减少了酶的失活，且比游离酶具有更高的稳定性。

参考文献

[1] Liu Chienhung, Chang Joshu. Lipolytic activity of suspended and membrane immobilized lipase originating from indigenous Burkholderia sp. C20[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 1616-1622.

[2] 吴东亮, 赵巧玲, 郭杨龙, 等. 含环氧基团的聚合物载体合成方法的改进及其固定化青霉素酰化酶[J]. 催化学报, 2010, 31(5): 586-590.

[3] Bayramoglu Gülay, Hazer Baki, Altintas Begum, et al. Covalent immobilization of lipase onto amine functionalized polypropylene membrane and its application in green apple flavor (ethyl valerate) synthesis[J]. Process Biochem, 2011, 46(1): 372-378.

[4] Vaidya Bhalchandra K, Ingavle Ganesh C, Ponrathnam S, Kulkarni B D, et al. Immobilization of Candida rugosa lipase on poly(allyl glycidyl ether-co-ethylene glycol dimethacrylate) macroporous polymer particles[J]. Bioresource Technol, 2008, 99(9): 3623-3629.

[5] Rodrigues Dasciana S, Mendes Adriano A, Adriano Welling S, et al. Multipoint covalent immobilization of microbial lipase on chitosan and agarose activated by different methods[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008, 51(3-4): 100-109

[6] Yi Songse, Noh Jinmi, Lee Yoonsik. Amino acid modified chitosan beads: Improved polymer supports for immobilization of lipase from Candida rugosa[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 57(1-4): 123-129.

[7] Yang Yong, Bai Yongxiao, Li Yanfeng, et al. Characterization of Candida rugosa lipase immobilized onto magnetic microspheres with hydrophilicity[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(11): 1179-1185.

[8] Kartal F, Akkaya A, Kilinc A. Immobilization of porcine pancreatic lipase on glycidyl methacrylate grafted poly vinyl alcohol[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 57(1-4): 55-61.

[9] Shen Bin, Wei Rongqing, Liu Xiaoning, et al. Flexible immobilization of papain on amino polystyrene support[J]. Journal of Chemical Industry and Engineering(China), 2005, 56(6): 1070-1075.

[10] Wei Rongqing, Shen Bin, Liu Xiaoning, et al. Flexible immobilized papain on the chitosan support[J]. 2005, 5(2): 183-187.

[11] 汪海萍，魏荣卿，沈斌等，双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶研究，生物加工过程，2004，2（1），25-29，

[12] Lin Sicong. Molecular Engineering Researches on Polymeric Biomaterial[J]. Polymer Bulletin, 1997, (1): 1-14.

[13] Gupta Shwsta, Kumar Yogesh, Singh Kripal, et al. Lipase immobilized on poly (vinyl alcohol) modified polysulfone membrane: application in hydrolytic activities for olive oil[J]. Polym Bull, 2010, 64(2):141-158.

[14] 周蕊, 魏荣卿, 刘晓宁, 等. 氯磺酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂[J]. 化工学报, 2010, 61(4): 1047-1051.

[15] 邹长军, 谭乃迪, 岳长进. 固定化Anti-HBsAg单克隆抗体及其含HBsAg血清体外吸附评价[J]. 精细化工, 2002, 19(5): 262-263.

[16] Winkler Ulrich K, Stuckmann Martina. Glycogen, hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens. Journal of Bacteriology, 1979, 138(3): 663-670.

[17] 王敏, 薛永强, 崔子祥. 环氧氯丙烷碱催化水解反应的研究[J]. 应用化工, 2010, 39(1): 49-51.

   通讯作者简介：周蕊（1984.2-）女，陕西咸阳人，陕西国际商贸学院，实验师，理学硕士，研究方向生物化学和化工方向。