低覆盖度的全基因组测序在智力障碍遗传诊断中的应用

【摘要】  目的  探讨低覆盖度的全基因组测序联合核型分析在智力障碍临床遗传诊断中的应用。方法  回顾性收集来自内蒙古呼和浩特市第一医院的智力障碍儿童，采用中国修订韦氏儿童智力量表进行智力评定，利用染色体核型分析和低覆盖度的全基因组测序（0.25×）对智力障碍儿童进行染色体核型和全基因组拷贝数变异（CNV>100kb）检测，对检出的变异进行致病性分析。结果  共纳入31例智力障碍儿童（男19例，女12例），年龄4-18岁。检测发现4例儿童为21三体综合征（男3例，女1例）；5例儿童发现存在致病性微缺失/微重复（男2例，女3例），分别涉及7q11.23、11p15.1p13、15q11.2q13.1、20q13.12q13.13和Xp22.13p11.21区域，均与智力障碍或发育迟缓相关；6例儿童存在临床意义不明的变异（男3例，女3例）；16例阴性（男11例，女5例）。结论  通过低覆盖度的全基因组测序联合染色体核型分析，可以提高智力障碍儿童的分子遗传诊断率，具有重要的临床意义。

【关键词】智力障碍; 染色体异常; 拷贝数变异; 二代测序

基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目（2014MS0815）  

呼和浩特市科技计划项目（呼和浩特市重大科技专项2014-社-重-2）

Analysis of Chromosomal Abnormalities by Low-pass Whole-genome Sequencing in Patients with Intellectual Disability

【Abstract】 Objective  To explore the application of low-pass whole-genome sequencing in clinical molecular genetic diagnosis of intellectual disability. Method  Children with intellectual disability from Hohhot First Hospital were recruited in this study. The intellectual assessment of the children was performed using the Chinese Wechsler Intelligence Scale for Children. The children were scanned by chromosome karyotype analysis and low-pass whole-genome sequencing for detection of chromosomal abnormalities and whole genome copy number variation (CNV). Variants in patients were performed to determine the pathogenicity and genetic source. Results  A total of 31 children with intellectual disability (males 19 cases and females 12 cases) were enrolled in the study. They were aged 4 to 18 years old. 4 children were found to be trisomy 21 (3 males and 1 females). 5 children (2 males and 3 females) were found to have pathogenic microdeletion/microduplication, involving 7q11.23, 11p15.1p13, 15q11.2q13.1, 20q13.12q13.13 and Xp22.13p11.21, respectively, were associated with intellectual disability or developmental retardation. 6 children (3 males, 3 females) had variations of undetermined significance, and 16 children (11 males, 5 females) were negative. Conclusion  The low-pass whole-genome sequencing combined with chromosome karyotype analysis can significantly improve the molecular genetic diagnosis rate of children with intellectual disability and can serve as a useful examinational tools in assisting diagnosis of children with intellectual disability.

【Key Words】 Intellectual Disability; Chromosomal Abnormalities; Copy number variation; Next Generation Sequencing

Fund program:

智力障碍（intellectual disability，ID）是发育阶段常见的一种神经发育障碍，以认知功能（IQ<70）和社会适应能力的显著受损为主要临床特征，通常在18岁前发病^[1]。智力障碍在普通人群中的患病率约为1%-3%^[2]。根据认知功能的缺陷程度可细分为极重度（IQ<20）、重度（IQ20-34）、中度（IQ35-49）和轻度（IQ50-69）^[3]。我国抽样调查显示0-6岁儿童智力障碍患病率为1.23%（12.25/1000），男女患者比例约为1.43:1^[4]。

智力障碍病因复杂多样，遗传或代谢因素占中重度智力障碍患者发病原因的50%-65%，占轻度智力障碍患者发病原因的20%^[5]。这些遗传因素包括染色体异常、单基因突变和多基因病等，其中染色体异常是智力障碍伴多发畸形患者最常见的遗传病因，约占15%-20%^[6]。

智力障碍是严重的社会问题，需要长期的康复训练和特殊教育来改善其生活自理能力和生活适应能力，给患者及其家庭带来沉重的精神和经济负担。因此，为智力障碍患者及家庭提供准确的病因诊断和遗传咨询显得尤为重要。本研究共收集智力障碍儿童31例，采用染色体核型分析和低覆盖度的全基因组测序对全基因组染色体数目变异和拷贝数变异进行检测，以评估智力障碍患者的遗传病因，为进一步诊治及遗传咨询提供科学依据。

对象和方法

一、对象

回顾性收集呼和浩特市第一医院2014年12月至2016年7月就诊的智力障碍儿童。入选标准：（1）年龄4-18岁；（2）智力障碍，采用中国修订韦氏儿童智力量表^[7]进行智力评定。 排除标准：（1）实验室检查明确的遗传代谢病（如苯丙酮尿症、半乳糖血症等）；（2）早产或围产期缺血、缺氧性脑损伤造成的智力障碍；（3）出生后中枢神经系统感染（如脑膜炎、脑炎）导致的造成的智力障碍；（4）外伤或手术所致智力障碍；（5）环境因素（如缺碘、重金属中毒等）造成的智力障碍。

二、方法

1. 收集临床资料。

用系谱的方式来描述和记录儿童和家人的相互关系以及可能与诊断有关的表型特征。同时记录治疗史和其他具有潜在意义的信息（如家族史等）。在儿童家长签署知情同意书的前提下，采取儿童及父母的外周血各5 ml。本研究已获得医院伦理委员会的批准。

2. 染色体核型分析

采用常规的G显带技术检测染色体数目及结构变异。

3. 低覆盖度的全基因组测序

使用QIAGEN（德国）试剂盒提取外周血DNA，具体方法参照试剂盒的说明书。基因组DNA先经超声波破碎（Covaris E220，美国）随机打断成200-250bp的片段，然后进行末端修复和接头连接。连接产物经磁珠纯化后进行PCR扩增，获得DNA文库。利用qPCR对文库质量进行评价。通过质量检测的DNA文库在NextSeq 500（Illumina，美国）高通量测序仪进行测序，测序读长为75bp。每样本的最终数据量为10M左右，基因组的覆盖度约为0.25×。

4. CNV分析

对测序仪获得的原始短序列，使用Trimmomatic v0.36^[8]去除接头和低质量的碱基。质控后的序列使用bwa v0.7.15^[9]比对到人类基因组hg19参考序列，同时标记PCR重复的reads。运用基于population-scale CNV calling（PSCC）^[10]方法，检测患者基因组上的CNV。

根据美国医学遗传学会对基因芯片拷贝数变异结果解读指南^[11]，参考欧洲人类遗传学杂志发表的CNV解读流程^[12]，具体分析过程如下：1）如果CNV片段>10Mb，则该片段为致病性的；2）与本地数据库进行比对，如果人群分布频率>1%，说明CNV为人群中比较常见即非致病性的CNV；3）与基因组变异数据库（Database of Genomic Variants）^[13]比对，如果数据库中出现次数n>5，片段间的相似度>0.75，表明CNV为正常多态即非致病性CNV。4）与已知微缺失/微重复综合征（Decipher）^[14]比对，片段大小与综合征相似度>80%，即为致病性CNV。5）不包含基因或重要功能性基因的CNV为非致病性的；6）CNV包含重要功能性基因，与数据库或文献中的疾病案例片段相似度>90%，且临床表型相似，注释为致病性CNV；7）CNV包含重要功能性基因，与数据库和文献中的疾病案例片段重叠或不重叠，但表型不一致，注释为不确定临床意义CNV。因此，CNV解读结果为非致病性变异、致病性变异和不确定临床意义变异3类。

结果

共入选31例智力障碍儿童（男19例，女12例），年龄4-18岁，所有儿童的智力均较同龄儿落后，或伴语言障碍、发育迟缓、癫痫等，无产伤及手术史。

我们检测发现4例儿童为21三体综合征患者（表1）。21三体综合征又名唐氏综合征（Down syndrome），是最早发现的染色体病，也是最常见的由单个病因引起的智力障碍，其发病率在活婴中的比例为1/600-1/800^[15]。患者临床表现多种多样，主要包括智力障碍（IQ20-50）、特殊面容、体格发育迟缓、婴儿期肌张力低下、先天性心脏病、消化道畸形等。

我们检测到5例儿童存在致病性的微缺失/微重复，分别涉及7q11.23、11p15.1p13、15q11.2q13.1、20q13.12q13.13和Xp22.13p11.21区域（表1）。其中，患者P5的7号染色q11.23区域存在1.57Mb的缺失，内含ELN, NCF1等重要的OMIM基因。该片段位于Williams-Beuren 综合征的关键区域（Decipher数据库）。WBS通常表现为患者有轻度至中度的智力障碍（IQ50-60）或学习困难，在口头、短期记忆和语言方面有相对好的认知能力，但在视觉空间构建（写作、绘画、模式构建）方面极度薄弱。独特的行为特征包括焦虑、注意缺陷多动障碍（ADHD）和过度友好。先天性心脏病的发生率为80%，大多数为肺动脉上狭窄（SVAS），少数为离散型肺动脉上狭窄。临床以散发为主，偶有家族性病例报道。该患儿的变异遗传自有智力障碍的母亲。患儿P6的11号染色体p15.1-p13区域存在14Mb的缺失，包含ELP4、KCNC1、CSRP3、ANO3、BDNF等13个重要的OMIM基因，为致病性变异。ClinGen数据库中收录一例类似变异的患儿（nssv584052），临床表现为先天性无虹膜，脑瘫，脑积水，小头畸形，白内障，整体发育迟缓。患儿P7的15号染色体q11.2-q13.1区域存在4.9Mb的重复，内含SNRPN、UBE3A、GABRB3、OCA2、HERC2等重要的OMIM基因，该片段位于Prader-Willi/Angelman综合征关键区域，已有研究报道^[16]累及该区域的重复与15q重复综合征（15q duplication syndrome）等疾病相关，临床表型包括不同程度的肌张力减退，智力障碍，自闭症谱系障碍，癫痫等。该患儿的变异为新发突变。患儿P8的20染色体q13.12q13.13区段存在4.12Mb的缺失，内含37个OMIM基因，其中常染色体显性遗传的OMIM疾病致病基因有PIGT（OMIM: 610272）和SLC12A5（OMIM:606726）。检索Clingen数据库已有多个小于该片段的缺失病例报道，如nsv2770316表现为发育迟缓；nsv532467表现为发育迟缓、癫痫、髋关节发育不良、肥胖、身材矮小等；nsv2770112表现为耳朵异常、语言发育迟缓、肌张力减退等。该患儿的变异遗传自有智力障碍的父亲。患儿P9的X染色体p22.13-p11.21区域存在39.8Mb的重复，含盖Xp11.22-p11.23微重复综合征（OMIM:300801）和Xp11.22相关智力障碍综合征（OMIM:300705）。其中，Xp11.22相关智力障碍综合征与智力障碍（轻度至中度）和语言发育迟缓相关，绝大多数的女性携带者表型是正常的，这与异常X染色体被选择性失活有关^[17]。相反，Xp11.22-p11.23微重复综合征与智力障碍（重度）、语言发育迟缓和脑电图异常相关，仅有少数女性携带者表型是正常的，存在正常X染色体被选择性失活和随机X染色体失活两种机制^[18]。该患儿的变异为新发突变。

此外，我们还检测到6例儿童携带临床意义不明的变异，涉及12q24.31、10q21.3、1q43、18q11.2及7q36.2、Xq28区域。其余16例儿童的检测结果为阴性。

表1 32例智力障碍儿童的临床表征和检测结果

Table1 Clinical characteristics and testing results of 32 children with intellectual disability

序号	年龄	性别	临床症状	常规核型	测序结果	变异 类型	分类 标准	来源
1	18	男	智力障碍	47,XY,+21	47,XY,+21	CN Gain	P	新发
2	13	男	智力障碍	47,XY,+21	47,XY,+21	CN Gain	P	新发
3	6	男	智力障碍，发育迟缓，十二指肠闭锁，2岁时会说话走路	47,XY,+21	47,XY,+21	CN Gain	P	新发
4	6	女	智力障碍，特殊面容，并指	47,XX,+21	47,XX,+21	CN Gain	P	新发
5	11	女	轻度智力障碍，轻度语言迟缓，先天性心脏病（房间隔缺损，肺动脉瓣关闭不全）	46,XX	7q11.23(72617031-74190930)x1	CN Loss	P	母亲 （智力障碍）
6	8	女	智力障碍，整体发育迟缓	46,XX,?del(11)p13p11.2	11p15.1p13(17702608-31699107)x1	CN Loss	P	未知
7	12	男	智力障碍，失语	46,XY	15q11.2q13.1(23571246-28474045)x3	CN Gain	P	新发
8	11	男	轻度智力障碍，生长发育落后，身材矮小，父亲和奶奶智力障碍。	46,XY	20q13.12q13.13(43839210-47960709)x1	CN Loss	LP	父亲 （智力障碍）
9	4	女	重度智力障碍，语言障碍；脑瘫；发育迟缓；四肢僵直	46,X,der(X)dup(X)(p11.23p22.31)	Xp22.13p11.21(18054130-57898829)x3	CN Gain	P	新发
10	14	男	轻度智力障碍；患儿心脏有异常，具体不详；多指；母亲智力障碍四级；父亲妹妹正常。	46,XY	1q43(239049010-239812309)x3	CN Gain	VUS	新发
11	8	女	智力障碍，不会说话，听力正常，运动正常，弟弟正常。	46,XX	7q36.2(153435231-153720330)x3	CN Gain	VUS	未知
12	16	男	智力障碍，语言发育迟缓，斜视，父亲、母亲、妹妹均体健。	46,XY	10q21.3(68177223-68545222)x1	CN Loss	VUS	母亲 （正常）
13	13	男	智力障碍，语言迟缓，特殊面容，易激惹	46,XY	12q24.31(121777347-122391446)x1	CN Loss	VUS	未知
					12q24.31(123567147-124657046)x1	CN Loss	VUS	未知
14	12	女	智力障碍	46,XX	18q11.2(19636024-19798723)x4	High Copy Gain	VUS	未知
15	13	女	智力障碍，语言迟缓	46,XX	Xq28(153771930-154206529)x3	CN Gain	VUS	未知
16	12	男	耳聋，自闭症，智力障碍、重度语言障碍，失语，抽搐症。父亲和爷爷听力差，母亲健康。	46,XY	阴性	-	-	-
17	14	男	智力障碍	46,XY	阴性	-	-	-
18	14	男	重度智力障碍，自闭症谱系障碍，语言障碍。	46,XY	阴性	-	-	-
19	10	男	重度智力障碍，头痛，斜视，共济失调，父母体健。	46,XY	阴性	-	-	-
20	11	男	智力障碍，学习困难度，语言障碍，多动，口齿排列不齐	46,XY	阴性	-	-	备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《渤海大学学报》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复