淫羊藿配方颗粒中淫羊藿苷的定量分析

王梦^1,2,3,王迎春^1,2,3,李斯¹,麻景梅^1,2,3,王相^1,2,3,刘佳旭¹,牛丽颖*^1,2,3

（1.河北中医学院，河北 石家庄 050091；2.河北省中药配方颗粒工程技术研究中心，河北 石家庄 050091；3.河北省高校配方颗粒应用技术研发中心，河北 石家庄 050091）

摘 要：目的：采用高效液相色谱法对淫羊藿配方颗粒中淫羊藿苷进行定量分析，明确其质量标准。方法：高相液相色谱法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液（29∶71）为流动相；检测波长270nm；流速：1ml/min；柱温：30℃，测定淫羊藿配方颗粒中淫羊藿苷的含量。结果：该方法简便、准确、重复性良好，可用于淫羊藿配方颗粒的质量研究。

关键词：淫羊藿配方颗粒；淫羊藿苷；高效液相色谱；定量分析

中图分类号：R284.1  文献标识码：A         文章编号：

Quantitative analysis of icariin in icariin formulation granules

WANG Meng^1,2,3,WANG Ying-chun^1,2,3,Li Si¹,Ma Jing-Mei^1,2,3,Wang Xiang^1,2,3,Liu Jia -Xu¹,NIU Li-ying*

(1 Hebei University of Medicine，Shijiazhuang 050091,China;2 HeBei TCM Formula Granule Engineering &Technology Research Center, Shijiazhuang 050091,China;3 TCM Formula Granule Research Center of HeBei Province University，Shijiazhuang 050091,China)

[Abstract]   Objective: To make quantitative analysis of icariin in icariin formula granules by high performance liquid chromatography (HPLC), and to clarify its quality standard. Methods: high phase liquid chromatography: using octadecyl silane bonded silica gel as filler; Acetonitrile-0.1% phosphate solution (29:71) is a mobile phase; Detection wavelength of 270nm; Flow rate: 1ml/min; Column temperature: 30 ℃, the determination of epimedium formula of epimedium glycoside content in grain. Results: the method is simple, accurate and repeatable, and can be used to study the quality of herba herba granules.

[Keywords]   icariin formulation granule; icariin;high performance liquid chromatography; quantitative analysis

淫羊藿配方颗粒是以小檗科淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim) 的干燥叶为原料，经提取、浓缩、干燥、制粒而成的。其主要有效成分为黄酮类，以淫羊藿苷为代表，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿的作用，临床上用于治疗腰膝酸软、风湿痹痛等症^[1]。但是目前没有统一、高标准的中药配方颗粒质量标准，导致中药配方颗粒质量良莠不齐，制约了中药配方颗粒生产企业严格质量管理、投入科研的积极性。因此研究和制定中药配方颗粒质量标准是亟待解决、刻不容缓的问题^[2]。

本文通过对淫羊藿配方颗粒进行深入研究，采用高效液相色谱法，对淫羊藿配方颗粒进行主要指标成分-淫羊藿苷的定量分析，明确淫羊藿配方颗粒的质量标准，为淫羊藿配方颗粒的生产加工、质量控制、和资源利用提供科学依据，以保证用药安全、有效、可控。

1.仪器与试药

高效液相色谱仪：日本岛津LC-20AT泵；SPD-M20A二极管阵列检测器；SIL-20A自动进样器；LC-solution色谱工作站。电子分析天平：TB-215D、BSA224S-CW （赛多利斯）。

淫羊藿配方颗粒（批号：14100921、14090221、14080221）购自神威药业集团有限公司；淫羊藿苷（批号：110737-200415）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯、水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液（29∶71）为流动相；检测波长270nm；流速：1ml/min，柱温：30℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算不低于2000^[3-5]。

2.2对照品溶液的制备  

精密称取淫羊藿苷对照品适量，加70%甲醇制成每1mL约0.045mg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备  

取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，精密加70%的甲醇25mL，称定重量，超声处理10分钟，取下，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3mL，置10ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.5系统适用性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进行测量，色谱图见图1。

A                                     B

A.对照品  B.供试品  I.淫羊藿苷

图1 HPLC色谱图

2.5线性关系  

精密吸取对照品溶液2、5、8、15、20μl按上述色谱条件测定。以测定的峰面积为纵坐标，淫羊藿苷的进样量为横坐标，绘制得标准曲线，淫羊藿苷进样量在0.0758～0.7584μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=2001799.5X-995，r=0.9999。

2.6精密度试验  

精密吸取对照品溶液7μl，依照上述色谱条件连续进样5次，计算峰面积RSD=0.04%（n=5），小于2%，说明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验  

精密称取淫羊藿配方颗粒（批号：14100921），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液3μl，依照上述色谱条件分别于0h、1h、2h、10h、20h进样测定，计算峰面积RSD=0.24%（n=5）。结果表明，供试品溶液在20小时内较稳定。

2.8重复性考察  

精密称取同一批样品（批号：14100921）9份，按上述2.3供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10μl，依照上述2.1色谱条件进样，计算得供试品溶液淫羊藿苷平均含量为43.98mg/g，RSD=0.40%表明该方法重复性良好。

2.9准确度考察  

采用加样回收法，取同一批样品（批号：14100921）6份，每份约0.03g，精密称定。精密加入一定量淫羊藿苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，依照上述色谱条件测定，平均回收率为99.59%（n=6），结果见表1。

表1  准确度考察结果

注：为节约对照品，样品的总体积不是25ml，是15ml，在浓度一致情况下，取样量减少。

2.10三批样品含量测定 

采用正文方法，对本品3批样品所含淫羊藿苷进行含量测定测定，结果见表2。

表2  三批样品淫羊藿苷测定结果

2.11耐用性试验  

为考察色谱柱的耐用性，取同一份供试品溶液（批号：14100921），选用不同型号的色谱柱进行测定，测定结果见表3。

表3 不同色谱柱测定同一样品含量

3.讨论

中国药典2010年版一部淫羊藿项下测定的淫羊藿苷的流动相是乙腈-水（30∶70），考虑到黄酮类成分带有多个酚羟基，为弱酸性，在自然界部分以游离体、部分以离子体存在，易出现波峰拖尾情况，将水更换为0.1%磷酸水溶性，可以克服拖尾情况^[6]。经多种色谱柱摸索，以乙腈-0.1%磷酸溶液（29∶71）为流动相，波峰分离良好，峰型对称。

淫羊藿苷属于黄酮类化合物，带二个糖分子，为水溶性化合物，所以采用50%、60%、70%甲醇进行样品处理，滤过，测定滤液中淫羊藿苷含量，决定提取溶剂^[7]。由测定的数据得知，虽然50%甲醇提取的淫羊藿苷含量的含量稍高一些，但三种不同浓度的甲醇提取效果，从统计学上是没有差异的，结合滤过速度考虑，选择60%甲醇为提取溶剂。本制剂中的淫羊藿苷已被煮提出来，从理论上只需超声溶解即可，所以取同一批样品（批号：14100921）选择10、15、20分钟，进行了超声考察，结果表明，超声10、15、20分钟含量结果基本一致，为了节省提取时间，所以选择10分钟进行超声提取。

同时，通过采用不同色谱柱用本文高效液相色谱方法进行同一样品的定量测定，结果基本一致，在不同色谱柱上，淫羊藿苷波峰分离良好，耐用性符合要求，说明该方法简便、准确、重复性良好，可用于淫羊藿配方颗粒的质量研究。

参考文献 (References)：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社，2010:306-308.

[2]李松林，宋景政，徐宏喜.中药配方颗粒研究浅析[J].中草药杂志，2009，40(增刊):1-7. 

[3]陈彦，蔡垠，贾晓斌，等.不同厂家淫羊藿配方颗粒主成分含量对比研究[J].中国中药杂志，2008，33(2):160-163.

[4]黄良永，雷震，郑江萍.淫羊藿药材及其配方颗粒中淫羊藿苷的含量比较[J]. 中国药师，2012，15(3):376-378.

[5]孙娥，贾晓斌，金晓勇，等.淫羊藿饮片中5种主要黄酮类成分的比较[J].中国医院药学杂志，2010，30(6):449-452.

[6]李作洲，徐艳琴，王瑛，等.淫羊藿属药用植物的研究现状与展望[J]. 中草药，2005，36(2):289-295.

[7]裴利宽，郭宝林.近10年淫羊藿药材及饮片研究进展[J].中国中药志，2007，32(6):466-471.

基金项目：河北中医学院青年科研基金资助项目（QNZ2016010）

           河北中医学院大学生创新创业训练计划项目（201814432082）