DC-CIK细胞治疗非小细胞肺癌的临床疗效观察

张静¹ 刘红菊² 张继先¹

¹湖北省中西医结合医院呼吸内科 湖北 武汉 430022

²华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科 湖北 武汉430022

[摘要]目的:对武汉协和医院经DC-CIK治疗的肺癌患者进行随访观察并检测治疗前后多个指标，探讨其治疗非小细胞肺癌的临床疗效及安全性。方法:选取2012年1月至2014年12月，确诊为非小细胞肺癌（NSCLC）的患者19例，所有患者都经过至少一次的DC-CIK治疗，观察治疗前后患者各种指标。结果:DC-CIK细胞治疗后，患者免疫功能提高；3例患者肺泡冲洗液中磷脂组分构成中，PC占比增加，PE占比下降；有效率31.6%，稳定率68.4%；1年生存率57.9%；大部分人生活质量改善；主要副作用为发热。结论:DC-CIK细胞治疗可以增强患者免疫功能，改善临床症状和生活质量，副反应少，有望用于肺癌治疗。

[关键词]树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）   非小细胞肺癌   临床疗效

目前在全球范围内，肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一^[1]，在我国每年约超过60万人死于肺癌，其中80%为非小细胞肺癌（NSCLC）^[2-3]。非小细胞肺癌是指除了小细胞肺癌外的鳞癌、腺癌等所有类型肺癌。由于起病很隐匿，多数患者就诊时已是肺癌中晚期，已错过了最好的治疗时机^[3]，多采用放化疗治疗，但由于放化疗严重的不良反应（骨髓抑制、胃肠反应等）、患者自身身体状况、耐药癌细胞、肿瘤干细胞、抗放射性细胞等因素的存在，导致其治疗受限。细胞生物免疫治疗因其可以调节机体天然的防御机制、激发机体对肿瘤的免疫反应、直接杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞生长，防止肿瘤细胞转移复发，且无明显毒副作用，逐渐成为肿瘤治疗的新的治疗方法^[4]。DC即树突状细胞，是体内一种通过摄取、加工处理、呈递抗原而激发机体特异性免疫反应的细胞。未成熟的DC摄取、加工抗原能力强，成熟的DC因其可高表达MHC-Ⅱ/Ⅰ类分子和共刺激分子，可有效的提呈肿瘤抗原，从而激发机体对肿瘤细胞的特异性免疫反应，同时还能通过分泌多种细胞因子和趋化因子（如IL-12、IL-10、TGF-β、IFN等），显著诱导或促使T细胞、B细胞活化和增殖 ^[5,6]。CIK细胞是在多种细胞因子（IFN-γ、IL-1、IL-2、anti-CD3等）的诱导下，由单个核细胞在体外培养而来的一群异质细胞，主要效应细胞是CD3⁺ CD56⁺ 双阳性T细胞^[7]，是目前已知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞。DC与CIK细胞共同培养后，增殖速率更快，细胞毒性更强，分泌的细胞因子增加，杀瘤效率更高^[8]，给于肺癌患者治疗后，患者的生活品质得到提高，食欲及睡眠质量得到改善^[9-11]。本课题通过对武汉协和医院经DC-CIK治疗的肺癌患者进行随访观察并检测治疗前后多个指标，探讨其治疗非小细胞肺癌的临床疗效及安全性。

研究资料与方法

1 研究对象资料

    在武汉协和医院2012年1月-2014年12月就诊的肺癌患者中选取19例经病理学或者细胞学确诊为非小细胞肺癌患者作为研究对象，根据国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行临床分期。其中，Ⅱ期患者2例，2例患者均不愿行手术和化疗治疗，单纯口服非特异性抗癌药物治疗，生物治疗前患者一般情况可，病情稳定，KPS评分＞90分。ⅢB期14例，14例中6例曾给予化疗，4例曾给予放化疗，3例曾给予放疗，1例曾给予手术及化疗；生物治疗前14例中10例病情稳定，4例进展，KPS评分90分者3例，80分者11例。Ⅳ期3例，其中骨转移3例，肾上腺转移1例，淋巴结转移3例，脑转移1例，肝转移1例，既往行化疗3例，手术治疗2例，放疗1例，3例中2例患者病情稳定，1例进展，KPS评分80分2例，70分1例。生物治疗距患者末次治疗（手术、放化疗）1月以上，且为第一次接受自体细胞免疫治疗。男性患者10例，女性患者9例，年龄35-70岁，中位年龄50岁，鳞癌7例、腺癌12例，19例患者均有影像学表现。入选标准：心、肝、肾等功能正常，无免疫系统疾病，KPS评分＞60分，预计生存期超过半年，同期只进行本项治疗，治疗前外周血淋巴细胞和单核细胞总数＞1×10⁹/l。排除标准：怀孕或者哺乳期妇女，曾行器官移植者，自身免疫性疾病患者，严重感染患者。在接受该治疗1-3个月后进行治疗效果评价，19例患者中，接受1周期者19例，2周期者4例，3周期2例；1月后复查的9例，2月后复查的3例，3月后复查的2例。本治疗经本院伦理委员会批准通过，所有患者及家属均签署知情同意书。

2 方法：

2.1 DC-CIK细胞培养及静注 由武汉协和医院干细胞治疗中心完成

    具体方法：外周血细胞单采、血细胞分离单采获得单个核细胞（PBMC），PBMC分离培养，贴壁的PBMC在加有GM－CSF、IL－4和TNF－α等的含自体血清的培养基中培养7天，得到DC；没有贴壁的PBMC在加有IFN-γ、anti－CD3mAb、IL－2、IL-1和含自体血清的培养基中诱导培养，得到CIK细胞。第7天将DC与CIK按照1∶10比例混合培养6天产生DC－CIK。取部分细胞进行细菌、真菌培养，待上述结果均为阴性后收集诱导扩增后获得的DC－CIK细胞，用生理盐水洗涤3次后再配制成100ml液体，用输血器1 h内静脉回输给患者，每天只输1次，每次回输细胞数2.5×10⁹，连续回输2 d，输注前30分钟给患者肌注25mg异丙嗪及10ml葡萄糖酸钙。 

2.2抽取患者治疗前后外周血送武汉协和医院干细胞中心，分别进行流式细胞术分析，包括白细胞分类（淋巴细胞比例、单核细胞比例、粒细胞比例）、淋巴细胞亚群（T淋巴细胞（CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺）、B淋巴细胞、NK细胞（CD3^-CD56⁺））。常规检查血常规、肝肾功能、心电图、肺功能，必要时复查肺部CT。

2.3 其中3名患者给予DC-CIK治疗前及治疗结束后（2例治疗12天后，1例治疗1月后复查时），均参照中华医学会制定的支气管肺泡灌洗规范^[12]，行支气管肺泡冲洗，用37℃的生理盐水分别按15ml 15ml 20ml灌洗3次，总量为50ml，回收的支气管肺泡冲洗液置于内壁涂硅的密闭容器内，记录支气管肺泡冲洗液的体积。支气管肺泡冲洗液中磷脂的提取、纯化按文献^[13]中方法进行，HPLC(高效液相色谱)系统进行色谱分析及数据处理。

统计学处理

    数据处理采用SPSS10统计软件和Excel统计软件，结果以±s表示，应用方差分析比较均数，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

3.1 DC-CIK细胞治疗对肺癌患者免疫功能影响

    9例患者治疗1月后复查，3例患者治疗2月后复查，2例患者治疗3月后复查。19例患者中，接受1周期者19例，2周期者4例，3周期2例。表1和表2为治疗1周期后患者外周血流式细胞术分析

表1  患者治疗前后外周血白细胞分类变化（±s，%）

（P＞0.05）差异无显著性差异

表2 DC-CIK细胞治疗肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群的变化(±s)

CD3⁺CD8⁺治疗后与治疗前比P＞0.05，差异无统计学意义，其余指标P＜0.05差异有统计学意义

表3 DC-CIK细胞治疗后患者外周血NK细胞变化(±s，%）

（P＜0.05）差异有统计学意义

3.2  DC-CIK治疗前后患者肺功能比较

19例患者中，按照2000年美国医学会的肺功能分级标准，治疗前肺通气功能轻度障碍者6例，中度者10，重度者3例。5例患者肺通气功能明显改善，8例患者肺通气功能未见明显变化，6例患者肺通气功能下降。

3.3  3例患者纤维支气管镜肺泡冲洗液中磷脂组分变化

肺癌患者DC-CIK治疗后与治疗前相比，肺泡冲洗液中磷脂组分构成中PC所占比例有所增加（治疗前79.50±5.15，治疗后82.10±6.20，单位：%），PE所占比例有所降低（治疗前7.50±2.03, 治疗后5.10±1.98单位：%）。

3.4参照世界卫生组织（WHO）实体瘤客观疗效评定标准，采用CT检查对比治疗前后瘤体大小，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和病变进展（PD）。计算有效率=（CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)，稳定率=（CR+PR+SD)/( CR+PR+SD+PD)。19例患者中，CR 0例，PR 6例，SD 7例，恶化6例，有效率31.6%，稳定率68.4%。

3.5随访观察1年，至随访结束，19例患者中11例患者存活，生存率为57.9%。

3.6表4 DC-CIK治疗后患者生活质量比较 

3.7 DC-CIK治疗后副作用 表5

3.8 DC-CIK治疗后副反应 表6

讨论

DC是体内重要的抗原提呈细胞，主要通过摄取、加工处理肿瘤抗原并将信息传递给机体的免疫细胞，诱导产生大量效应T细胞、分泌趋化因子及细胞因子等发挥抗癌作用。CIK细胞是一种新型的免疫活性细胞，1991年Schmidt-Wolf等首先报道了CIK细胞的诱导方案，该实验是在人B型淋巴瘤SCD鼠动物模型上进行，并与LAK细胞进行对比，实验证明CIK比LAK细胞具有更强大的杀瘤活性，这主要归因于CIK细胞中的CD3⁺ CD56⁺细胞^[7],该细胞同时被CD3和CD56标记^[14],因而同时具有像T淋巴细胞一样强大的抗肿瘤细胞的活性和NK细胞样的非MHC限制性杀瘤作用的特点，很多人^[15-20] 通过实验证明了CIK的这一特点。CIK细胞杀伤瘤细胞的作用机制目前尚未完全清楚，目前认为主要是通过对肿瘤细胞的直接杀伤作用、分泌很多细胞因子、诱导肿瘤细胞凋亡等方面发挥抗瘤作用。Marten A 等^[8]将 DC与CIK共同培养，发现两者相互促进，共同成熟，DC分泌的IL-12明显增加，CD3⁺CD56⁺细胞显著增加，CIK细胞抗瘤作用也增强，而阻断IL-12的作用后，CIK的抗瘤效应随之明显减低。大量研究^[21-23]表明DC-CIK治疗肺癌有效率高达42%左右。YU CUI 等^[9]对118位癌症患者进行DC与CIK联合治疗的研究，研究表明，联合治疗提高了患者的生活质量，改善了患者的食欲及睡眠质量，副作用有发热、失眠、厌食、关节痛、皮疹等，经过对症处理后均可好转，无严重不良事件产生。

T淋巴细胞亚群是构成机体免疫防御的重要因素，主要由CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺两个亚群组成，CD3⁺CD4⁺为辅助/诱导T细胞，辅助B细胞产生抗体，分泌细胞因子，调节免疫反应，CD3⁺CD8⁺为抑制/细胞毒T细胞，有免疫抑制和细胞毒性作用^[24]。CD3^-CD56⁺ 为NK细胞（自然杀伤细胞）的一种亚群，具有杀伤肿瘤细胞的作用。本课题中19例非小细胞肺癌患者，进行DC-CIK细胞治疗前，所有患者外周血白细胞分类中淋巴细胞比例都在正常范围内，中性粒细胞数值在正常范围，比例稍微高于正常值，患者均不存在严重的感染。通过表1、2中数据可以看出患者存在正常的免疫功能，适宜行DC-CIK细胞治疗。研究结果表明行DC-CIK细胞治疗后，患者白细胞分类中淋巴细胞有所增加，但无统计学意义，外周血中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3^-CD56⁺较治疗前增加，CD4⁺/CD8⁺比例增加，差异有统计学意义，CD3⁺CD8⁺降低，差异无统计学意义，表明患者细胞免疫功能增强，对一般病原菌的抵抗力增强。其中2例患者为Ⅱ期，均不愿行手术和放疗治疗，单纯口服非特异性抗癌药物治疗，生物治疗前患者一般情况可，病情稳定，但是经DC-CIK治疗后，他们的治疗效果不明显，淋巴细胞亚群水平未见明显变化，肺功能未见明显改善，也没有明显的副作用。

19例患者中大部分人体力、体重、食欲、睡眠质量得到不同程度改善，患者对治疗信心增加，依从性更好。大部分（89.5%）患者经DC-CIK细胞治疗后有不同程度的粒细胞降低，给予粒细胞集落刺激因子治疗后好转。2例患者有轻度的肝功能受损，给予护肝药物治疗，转氨酶恢复正常。发热是主要的不良反应，经物理降温、解热镇痛药等对症处理后好转，其他不良反应（如失眠、厌食、胃肠道反应、关节痛等）经对症处理后也会好转，未影响患者的生活。1例患者髋骨骨折，这可能与骨转移有关。1例患者偏瘫，经行颅脑MRI检查，结果表示可能是肿瘤转移引起

    5例患者肺通气功能明显改善，8例患者肺通气功能未见明显变化，6例患者肺通气功能下降。对3例患者纤维支气管镜肺泡冲洗液中磷脂组分进行分析，发现肺癌患者DC-CIK治疗后与治疗前相比，肺泡冲洗液中磷脂组分构成中PC所占比例有所增加（治疗前79.50±5.15，治疗后82.10±6.20，单位：%），PE所占比例有所降低（治疗前7.50±2.03, 治疗后5.10±1.98，单位：%）。众所周知，肺表面活性物质系统主要由磷脂酰胆碱（PC）组成，磷脂酰乙醇胺（PE）比例很少，PE仅参加细胞的膜性成分。在临床工作中，我们发现有些给予DC-CIK治疗的患者，呼吸困难症状有一定程度改善，可能与患者肺表面活性物质PC含量增加有关。

    中国肿瘤统计年报数据显示：我国目前肺癌的发病率和死亡率呈持续走高态势，按目前趋势十年后我国肺癌病人将达到 100 万,成为世界第一位的肺部恶性肿瘤，其中更为高发的是NSCLC。NSCLC 恶性程度高，转移快，病人中位生存期仅 7-10 月^[25,26]。肿瘤免疫治疗，源于诱导自身细胞免疫、抗癌作用强大、更无常规治疗的副作用，治疗多种肿瘤效果较为确切^[27]。本研究一定程度上反应DC-CIK细胞治疗非小细胞肺癌安全、有效，明显改善患者的生活质量，毒副反应小，有希望是多重耐药肿瘤的潜在治疗策略，有可能成为非小细胞肺癌的新的治疗方法。但是DC-CIK细胞治疗也存在缺点，如部分患者治疗后无效或治疗效果不佳，这可能是因为DC-CIK没有有效的打破患者自身对肿瘤的免疫耐受，没有激发强有力的细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，也没有激发足够的NK细胞。肿瘤免疫发展的关键是制备高效的肿瘤疫苗，目前研究较多的主要包括两大类^[28]：腺病毒(rAd)肿瘤疫苗和树突状细胞(dendritic cell, DC)肿瘤疫苗。抗原修饰疫苗效果最为靶向确切，但非常明确的肿瘤抗原现阶段仍仅限于黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤，肺部 NSCLC至今尚无法明确特异性肿瘤抗原，因而无法构建有效的抗原修饰疫苗。TP53 基因作为一种非常经典和重要的抑癌基因，一直以来受到广泛的关注和研究^[29]。其编码的 P53 蛋白是一种应激反应蛋白，可以通过调节基因转录来应对基因毒性应激、癌基因信号激活以及 DNA 损伤等不利因素。近来的全基因组关联研究（genome wide association study, GWAS）提示 TP53 基因是人类恶性肿瘤中突变频率最高的基因之一^[30]。其他抑癌基因突变后仅仅是丧失了抑癌功能，而 TP53 基因突变后可非常独特地获得新的促癌功能^[31]。有关野生型的 TP53基因的抑癌作用和突变型的 TP53 的致癌功能，一直都是生物学界研究的热点。目前已有许多有关 TP53 突变在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中作用的研究，研究^[32-34]发现除了已研究的如 EGFR、KARS、ALK 等基因，TP53 也是肺腺癌最常见的驱动基因，有报道^[35,36]在动物实验中发现含有 TP53 突变的小鼠肿瘤更具侵袭性更容易转移。临床证据^[37]也显示 TP53 基因突变与恶性肿瘤的预后差有关。Alberto 等^[38] 2010 年观察到Ad-p53-DC 在临床上治疗NSCLC，结果显示Ad-p53-DC 激发诱导了强烈的抗肺部肿瘤的免疫反应，也明显延缓了已建立的肿瘤的生长速度。在其它系统肿瘤（乳腺癌、肝癌等）也观察到同样的效果^[39]：p53 的 DC 疫苗的应用或激活抑癌基因 p53 均可缩小肿瘤，甚至可以使肿瘤消失。类似Ad-p53-DC样的肿瘤疫苗用于治疗NSCLC是非常有前景价值的。

    本研究由于临床病例较少，没有与放化疗等其他治疗方法进行对比，随访时间短，仍需扩大病例及多中心研究来进一步证实其疗效，并深入探讨其作用机制。

[作者简介]张静（1988-）女，住院医师，医学硕士，目前于湖北省中西医结合医院呼吸内科工作。联系电话：13886125748，邮箱：903275198@qq.com

通讯作者：刘红菊（1969-），女，副主任医师，医学博士，于武汉市协和医院呼吸内科工作

邮箱：liuhjorange@ya-hoo.com

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