猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

郑培 张飞 贺笋^*

（天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011）

摘要：新疆奇台、昌吉规模化猪场发生育肥猪急性死亡，持续多日，抗生素治疗效果不明显。为确诊疾病及提供有效的治疗方案，对疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪进行临床诊断和病理组织学观察，采集病料进行细菌的分离培养，结合PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等进行系统鉴定。结果，剖检死亡猪可见典型的出血性纤维素性胸膜肺炎。奇台猪场分离鉴定获得2株胸膜肺炎放线杆菌，昌吉猪场获得1株胸膜肺炎放线杆菌，分型鉴定均为血清5型。小鼠致病性试验显示，奇台株和昌吉株均可致死小鼠。药敏试验结果显示，菌株对氟苯尼考、头孢噻呋、恩诺沙星等敏感。结论，结合临床症状、病理剖检和实验室诊断，确诊为猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型。猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型已成为新疆的流行血清型。

关键词：猪传染性胸膜肺炎；PCR鉴定；药敏试验；动物致病性试验

Isolation and Identification of Actinobaccilus pleuropneumoniae

Zheng Pei, Zhang Fei,He Sun

（Tecon Biological Co.,Ltd.，Xinjiang Urumqi 830011）

Abstract: The fattening pigs acute died were happened in pig farms of Xinjiang Qitai and Changji cities. It last for several weeks and the antibiotic treatment effect was not obvious. In order to diagnosis of the disease and provide effective treatment,the sick pigs were carried on clinical diagnosis、histopathological observations.The systematic analysis of isolation strains were conducted by laboratory diagnostic methods,included PCR detection,Antimicrobial susceptibility tests,and mouse pathogenicity experiment.As a result, a typical hemorrhagic fibrinous pneumonia was observed in the dead pigs.2 strains were isolated from Qitai farm,and 1 strain from Changji farm.The result of PCR typing identification showed all isolated strains were serotype 5 and could be lethal to mice.The isolate strains were sensitive to florfenicol,cefotaxime and enrofloxacin.Conclusion, combined with clinical symptoms, pathological necropsy and laboratory diagnosis, The strains confirmed as Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5. Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5 has become a popular serotype in Xinjiang.

Key words: porcine contagious pleurneumonia; PCR detection;drug susceptibility test;mouse pathogenicity experiment

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种急性致死性呼吸道传染病，是威胁各国养猪业的最重要的细菌病之一，其主要特征为出血性纤维素性胸膜肺炎和纤维素性坏死性胸膜肺炎。胸膜肺炎放线杆菌划分为巴氏杆菌科放线杆菌属，革兰氏阴性小杆菌，有荚膜。现已鉴定的APP有15个血清型，同一猪场可能存在不同血清型，血清型1型、5型、9型和11型通常被认为强毒力菌株。不同血清型之间的交叉保护力较弱，抗生物治疗效果有限，且大量抗生素的使用，也会导致使耐药菌株产生，致使该疾病防控困难。

2018年9月中旬，新疆奇台某1500头猪场，育肥猪突发急性死亡，半个月内，死亡100头。临床表现为患病猪食欲废绝，体温升高，呼吸困难，急性死亡猪口鼻流出带血的红色泡沫。使用氟苯尼考、替米考星等药物控制疾病，效果并不明显。同月在新疆昌吉某猪场育肥舍也出现育肥猪急性死亡，临床症状症状与奇台猪场相似。初步怀疑为猪传染性胸膜肺炎，采集病料，进行细菌的分离鉴定。本试验通过临床剖检、PCR检测、病理学等手段进行确诊，分离获得APP血清5型菌株，并进行了药敏试验和动物致病性试验，为该疾病的诊断和防控提供依据。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料的来源及采集  病料采自新疆奇台和昌吉某猪场死亡的育肥猪。无菌采集肺脏、胸腔积液、淋巴结等组织病料。

1.1.2 标准菌株  猪传染性胸膜肺炎标准菌株（血清1型、2型、3型、5型、7型）和金黄色葡萄球菌标准菌株，均购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 培养基与试剂  TSA培养基和BHI培养基，均购自BD公司；NAD，购自Roche公司；革兰氏染液和微生物生化鉴定管，购自杭州天和微生物有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL-2000 Marker，均购自Thermo公司。

1.1.4 引物  参见肖国胜^[1]、Stein Ø^[2]和Jessing SG^[3]等合成APP通用型鉴定引物和APP血清1型、2型、3型、5型和7型分型鉴定引物，如表1所示，由北京博迈德生物技术有限公司合成。

表1 引物信息

1.1.5 试验动物  18~22g健康的雌性昆明小鼠，购自新疆医科大学实验动物中心。

1.2 方法 

1.2.1  临床症状和剖检观察  通过观察临床症状和剖检病死猪，进行初步诊断。

1.2.2  细菌分离  无菌采集肺脏、胸腔积液、淋巴结等病料，分别划线于TSA培养基和含10μg/ml NAD的TSA培养基，置37℃培养18~24h，观察细菌生长状况及菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。挑单菌落划线接种于TSA培养基，垂直于APP划线再划一条金黄色葡萄球菌接种线，置37℃培养24h，观察金黄色葡萄球菌周围是否存在卫星现象。挑取单菌落接种于BHI液体培养基培养16~18h，观察细菌生长状况。

1.2.3 生化试验  将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、M.R、V.P、尿素和硝酸盐还原酶等生化鉴定管中，分别加入1μl NAD，混匀。然后接种各分离菌株，倒置于37℃恒温培养箱培养36~48h，每日观察并记录试验结果。

1.2.4  PCR鉴定  挑取疑似单菌落，接种至含10μg/ml NAD的BHI培养基，37℃恒温摇床培养过夜。取1~1.5 ml菌液，12 000 r/min离心2 min，倒去上清，加入100 μl双蒸水，反复吹打重悬菌体，煮沸10 min，冰浴数秒，12 000 r/min离心2 min，吸取上清为PCR反应模板。分别使用APP通用引物和1、2、3、5、7型分型引物进行PCR鉴定，引物序列见表1。25μl反应体系：分别加入2×PCR mix buffer 12.5μl，10 μmol/l上下游引物各1μl，模板1μl，剩余补加双蒸水。95℃ 5 min；94℃ 30 s，55~60℃ 30 s，72℃ 30 s~1 min，30个循环；72℃ 8 min。同时设立标准菌株阳性对照和阴性对照。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并进行回收测序。

1.2.5 药敏试验（K-B纸片法）  选用氟苯尼考、恩诺沙星、阿莫西林等临床上常用药物对分离的奇台株和昌吉株进行药敏试验。将培养过夜的菌液，用PBS将菌液调至含菌量约为5×10⁷~5×10⁸CFU/ml的浓度。然后用灭菌的棉签蘸取细菌悬液，均匀涂布于含NAD的TSA培养基，静置3~5min，用镊子夹取药敏片贴于培养基上，置37℃恒温培养箱培养48h，测量并记录每个药敏纸片抑菌圈的直径。

1.2.6 动物致病性试验  按0.2%接种量将冻存菌种接种于20ml含10μg/ml的BHI液体培养基中，过夜复苏培养，制备种子液。将种子液按1%接种量接种20ml含10μg/mlBHI液体培养基培养菌液6小时至对数中期，活菌计数。用BHI液体培养基将菌液10倍梯度稀释至攻毒剂量。

以腹腔攻毒的方式进行小鼠攻毒，0.5ml/只。每个分离菌株设5个攻毒梯度，每个攻毒梯度10只小鼠，另设10只小鼠作为健康对照。攻毒后连续7日，每日观察小鼠的食欲、活力及死亡状况。所有存活小鼠于攻毒后第7日剖检，观察主要脏器病变情况。参照Reed-Muench法计算小鼠LD₅₀。

2  结果与分析

2.1  临床症状和病理学观察

临床可见病猪精神沉郁、咳嗽、高热和腹式呼吸等症状。急性发病猪可见口鼻流血，快速死亡。剖检死亡猪只，呈现典型的纤维素性出血性胸膜肺炎症状，可见肺脏与胸腔粘连（图1A），胸腔内大量积液，肺脏出血水肿（图1B），肺间质明显增宽，气管内大量泡沫状分泌物。

                  A                                B

A，肺脏与胸膜粘连；             B，纤维素性出血性肺炎

A,Lung and pleural adhesions;       B,Fibrinous hemorrhagic pneumonia

图1 剖检病变观察

Fig.1 Postmortem examination

病理学观察可见肺不张（图2A），肺泡隔毛细血管扩张，肺泡腔内充满红细胞、纤维蛋白、浆液和脱落的上皮细胞；肺间质明显水肿，增宽，大量炎性细胞浸润（图2B）。      

                A                                     B

A，肺不张；                        B，炎性细胞浸润

             A, pulmonary atelectasis;              B,Inflammatory cell infliltration

图2 组织病理学观察

Fig.2 The results of histopathological abservation

2.2  细菌分离

将肺脏、胸腔积液、淋巴结等病料接种至含10μg/ml NAD的TSA培养基，培养24h，可见圆形、表面隆起、光滑、半透明的小菌落。革兰染色镜检，可见革兰阴性小球杆菌（图3）。不含NAD的TSA平板无菌落生长。在金黄色葡萄球菌菌落周围可见到“卫星现象”。在BHI液体培养基中，生长良好。

   图3 镜检图片（100×）

 Fig.3 Microscopic examination(100×)

2.3  生化鉴定结果  

如表2所示，2株分离菌株（奇台株和昌吉株）均可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，山梨醇、MR和VP反应阴性，尿素和硝酸盐还原酶反应阳性。2株分离菌株均符合猪胸膜肺炎放线杆菌的生化特性。

表2 生化试验结果

Table 2 The results of biochemical test

2.4  PCR鉴定结果

APP分离菌株与标准菌株经通用引物和分型鉴定引物扩增后，进行电泳检测。分离菌株利用APP apxIV通用引物可扩增出与预期目的条带大小一致的约346bp的目的片段。利用AP5分型引物可扩增出与预期目的片段大小一致的约1100bp的目的片段。1、2、3、7型分型引物未扩增出目的条带。将测序结果于GenBank进行BLAST比对，同源性为99%。检测结果显示此次分离到的病原菌为APP血清5型。

1、2,奇台株；3、4,昌吉株；+,标准菌株对照；1、2,奇台株；3、4,昌吉株；+,标准菌株对照；

-,阴性对照；M，DL2000 DNA Marker         -,阴性对照；M，DL2000 DNA Marker

图1 apxIV通用引物PCR扩增结果       图2 APP5型鉴定引物PCR扩增结果

Fig.1 The PCR amplification results of APP strains  Fig.2 The PCR amplification results of APP5

2.5 药敏试验

药敏试验结果如表3所示，奇台株和昌吉株对氟苯尼考、头孢噻呋、恩诺沙星等均较敏感，对替米考星、氧氟沙星、林可霉素、阿莫西林耐药。

表3 药敏试验结果

Table 3 The drug susceptibility test result

抑菌圈直径（d）＜15mm，耐药；15mm≦d＜18mm，中介；d≧18mm，敏感

Inhibitory zone diameter(d)＜15mm,Resistance;15mm≦d＜18mm,Intermediate;d≧18mm,sensitive

2.6 动物致病性试验

空白对照组小鼠全部正常，分离菌株腹腔注射小鼠后，24h~72h部分小鼠出现急性死亡，死亡情况如表4所示。剖检死亡小鼠可见肺脏弥散性出血，脾脏肿大等症状。无菌采集肺脏和脾脏进行分菌，均可分离出纯培养物。根据 Reed-Muench法计算小鼠LD₅₀，奇台株为3.9×10⁷CFU/0.5ml，昌吉株为4.8×10⁷CFU/0.5ml。

表 4   小鼠死亡情况统计

Table 4 mice mortality

稀释度dilution	小鼠死亡统计Mortality
	奇台株Qitai strain	昌吉株Changji strain
100	10/10	10/10
10-1	10/10	10/10
10-2	7/10	6/10
10-3	0/10	1/10
10-4	0/10	0/10
空白对照	0/10 备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《实用防盲技术》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复