黄芪多糖通过抑制PKC/MAPK通路修复人足细胞裂孔膜

顾叶云，任现志，徐蕾

(南京中医药大学儿科研究所，江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室)

文章已被长春中医药大学学报杂志社录用，长春中医药大学学报杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/changchunzhongyiyaodaxuexuebao

摘 要：目的：探讨核苷酸嘌呤霉素对人足细胞的损伤作用及黄芪多糖的修复作用，并探索PKC/MAPK通路是否参与其中，寻找可能存在的作用机制。方法：用CCK-8法筛选合适的核苷酸嘌呤霉素造模浓度及黄芪多糖的最大无毒浓度，予核苷酸嘌呤霉素刺激人足细胞造成损伤，予不同浓度的黄芪多糖处理后，应用RT-PCR法检测nephrin和podocin的mRNA表达情况，Western blotting法检测nephrin、podocin、PKC、JNK及p38蛋白水平的表达情况。结果：核苷酸嘌呤霉素刺激后，nephrin和podocin的mRNA及蛋白的表达明显降低，而用药后又有上升，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），溶剂对照组无明显改变，即无统计学差异（P＞0.05），而模型组PKC、JNK和p38的表达明显升高，用药后逐渐降低（P＜0.05），亦表现出浓度依赖性，溶剂组无明显改变（P＞0.05）。结论：核苷酸嘌呤霉素能造成人足细胞裂孔膜损伤，黄芪多糖对这种损伤有修复作用，而PKC/MAPK通路参与修复过程，同时这种修复作用与黄芪多糖浓度呈正相关。

关键词：黄芪多糖；人足细胞；nephrin；podocin；PKC/MAPK通路

中图分类号：    文献标志码：        文章编号：

PKC/MAPK pathway participates in the repair of the damage of human podocyte slit diaphragm by astragalus polysaccharides

GuYeyun，REN Xianzhi ，XU Lei

(Institute of Pediatrics, Nanjing University of Chinese Medicine;Key Laboratory of children's respiratory diseases (traditional Chinese Medicine) in Jiangsu)

Abstrate：Objective：To investigate the damage effects of puromycin aminonucleoside (PAN) on human podocyte and the repair effect of astragalus polysaccharides.At the same time,to explore whether PKC/MAPK pathway is involved in it to seek possible mechanisms.Method：To filter appropriate concentration of model establishment of PAN and the maximum non-toxic concentration of astragalus polysaccharides by cytotoxicity test CCK-8.In the experiment,PAN was used to cause the damage of human podocytes and then different concentrations of astragalus polysaccharides was treated with cells.Finally,the mRNA expression levels of nephrin and podocin were detected by RT-PCR as where as the  protein expression levels of nephrin, podocin, PKC, JNK and p38 were detected by Western blotting.Result：The mRNA and protein expression levels of nephrin and podocin were  declined obviously after stimulating by PAN and ascended after treatment with astragalus polysaccharides,furthermore,these changes were in a dose-dependent manner.The difference was statistically significant(P<0.05).However,the changes between solvent control group and model group were unconspicuous,which showed no significant difference(P>0.05).What’s more,the protein expression levels of PKC,JNK and p38 in injured human podocytes were increased significantly in model group than those in normal group (P＜0.05),and after treating with different concentrations of astragalus polysaccharide,the expressions were decreased in varying degrees(P<0.05).It was inproved that the effects had nothing to do with solvent(P>0.05).Conclusion：PAN can cause the damage of human podocyte slit diaphragm and astragalus polysaccharides can repair the injury which is positively correlated with astragalus polysaccharides.Meanwhile,PKC/MAPK pathway is involved in the repair process.This may be the possible mechanism of  astragalus polysaccharides on the repair of human podocytes.

Key words：astragalus polysaccharides；human podocyte；nephrin；podocin；PKC/MAPK pathway

原发性肾病综合征（Primary nephrotic syndrome,PNS）是以大量蛋白尿、明显水肿、高脂血症及低白蛋白血症为主要表现的由多种因素诱导的肾小球疾病。就传统医学而言，大多数学者认为本病的发病机制可归结为因外感内伤所致的“肺脾肾”三脏功能失司，精微渗泄、水液内停，多属本虚标实或虚实夹杂。故治疗以“益气”为主，而黄芪既是补气上选药物又能利水消肿，且现代药理研究表明黄芪具有降低甘油三脂、胆固醇；降低肾脏对白蛋白的排泄、升高血白蛋白的作用。^[1]因此，临床上使用黄芪治疗肾病综合征率颇高。Nephrin是裂孔隔膜上第一个被发现的跨膜蛋白，很多研究证实Nephrin表达和分布的改变可导致裂孔隔膜结构丧失，进而导致大量蛋白尿及肾衰竭。^[2]podocin与nephl、podocin组成受体复合物，编码这些蛋白的基因缺失及突变，将导致肾小球滤过功能障碍。有研究表明，该复合物和其它细胞间连接蛋白一起与细胞骨架相关蛋白互相作用，共同调节足细胞的形态学和动力学^[3]。黄芪多糖（APS）是黄芪的主要活性成分，有实验证实APS能够抑制PDGF-BB表达，达到改善肾小球纤维化，延缓肾病进程^[4]。故本研究选用黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）治疗核苷酸嘌呤霉素（Puromycin aminonucleoside,PAN）诱导损伤的人足细胞裂孔膜，观察nephrin及podocin mRNA及蛋白表达的改变，旨在探讨PAN对人足细胞的损伤作用及APS的修复作用，并探索PKC/MAPK通路是否参与其中，寻找可能存在的作用机制。

1  材料与方法

1.1  实验细胞  

    人肾小球足细胞，由南京军区总医院馈赠，此次实验所用细胞均为第2-3代处于对数分裂期的细胞。细胞增殖时加入10%全培（每100ml中含有FBS10ml，RPMI-1640单培90ml，双抗1ml，ITS1ml及支原体祛除剂1ml）于33℃，5% CO₂ 恒温培养箱培养至约60%-70%后转移至37℃，5% CO₂ 恒温培养箱进行分化，7天后用于实验。黄芪多糖购自于四川维克奇公司，纯度为98%，批号分别为：150927，用生理盐水溶解形成5mg/ml的母液。

1.2  实验药物

核苷酸嘌呤霉素（MedChen Express公司，批号：58606）；黄芪多糖（四川维克奇公司，纯度：98%，批号：150927）。

1.3  实验试剂与仪器

胎牛血清(gibco公司，批号：)，Cell Counting Kit-8（CCK-8）（日本同仁公司），nephrin兔多克隆一抗（密理博，货号：abt331），podocin兔多克隆一抗（货号：ab50339）、PKC兔多克隆一抗（货号：ab32376）、JNK兔多克隆一抗（货号：ab179461）、p38兔多克隆一抗（货号：ab170099）均购自Abcam公司，tubulin兔多克隆一抗（proteintech公司，货号：ab11224-1-AP）。

CO₂培养箱：（日本SANYO公司）、电子天平（上海天平仪器厂）、Olympus BX51光学显微镜（日本Olympus公司）、超灵敏化学发光成像仪（美国Bio-rad公司）、蛋白半干转仪、WesternBlotting Box（美国Bio-rad公司）。

1.4  模型的制备、分组及给药

在96孔板中培养细胞至贴壁后，用含有2%血清的维持液（每100ml中含有FBS2ml，RPMI-1640单培98ml，双抗1ml，ITS1ml及支原体祛除剂1ml）同步化12h，再依次加入不同浓度的嘌呤霉素（PAN），分别孵育8h、24h、48h后，每孔加10μl CCK-8，再孵育2h，用全自动酶标分析仪检测OD值。同法测定黄芪多糖对人足细胞的最大无毒浓度。

人足细胞接种于6孔板中，除正常组外，每孔加2.0ml PAN，孵育24h，吸弃细胞培养液，给药组加不同浓度的黄芪多糖及溶剂对照，正常组、模型组加维持液，37℃，5% CO₂ 恒温培养箱继续培养24h。

1.5  观察指标与方法

根据Invitrogen的Trizol说明书，提取各组细胞中的RNA及蛋白后，检测各组RNA和蛋白浓度，根据abm 5×All-In-One RT MasterMix试剂盒说明书进行逆转录和abm EvaGreen 2× qPCR MasterMix试剂盒进行nephrin及podocin mRNA水平检测。蛋白定量后，100℃加热5min进行变性，选用8%的SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，用10%脱脂奶粉封闭后先后与一抗、二抗孵育，ECL检测样本免疫活性，凝胶成像系统分析，Image J软件得出灰度值。各一抗抗体均按1:1000稀释后使用，二抗按1:5000稀释后使用。

1.6  统计学处理

实验数据采用SPSS17.0软件进行分析处理，结果以均数±标准差（x±s）表示，多组间两两比较采用单因素方差分析，方差不齐采用Kruskal-wallis Test检验。P<0.05表示有差异性，P＞0.05表示无统计学意义。

2  结果

2.1  嘌呤霉素造成足细胞损伤的最佳浓度及作用时间

表1 不同浓度的嘌呤霉素及作用时间下人足细胞的存活率

由上表可知，PAN浓度为50ug/ml作用24h时人足细胞的存活率在50%左右，故实验选择50ug/ml作用24h进行造模。

2.2  黄芪多糖对人足细胞的最大无毒浓度

表2 不同浓度的黄芪多糖作用于人足细胞后的细胞存活率

  根据上表中实验结果，本次实验中选择400ug/ml作为最大无毒浓度，同时选用100ug/ml及200ug/ml作为低、中浓度组，且设同等浓度的生理盐水进行溶剂对照。

2.3  各组中nephrin和podocin的mRNA表达

    如表3所示：PAN作用与人足细胞后，模型组nephrin及podocin的表达量较正常组均明显下降（P＜0.05），差异有统计学意义；而应用不同浓度的黄芪多糖后nephrin及podocin的表达量均有不同程度的上升，nephrin仅在高浓度组、podocin在中浓度组及高浓度组与模型组相比均有统计学差异（P＜0.05），故可以认为黄芪多糖能上调损伤足细胞中nephrin及podocin mRNA的表达，且具有浓度依赖性，而生理盐水对照组中nephrin及podocin的mRNA表达与模型组无统计学差异（P＞0.05）。

表3  各组中nephrin和podocin的mRNA表达水平（n=6，x±s）

注：*：与正常组相比，P＜0.05；#：与模型组相比，P＜0.05

2.4  各组中nephrin、podocin、PKC、JNK、p38的蛋白表达

表4  各组中nephrin、podocin、PKC、JNK、p38的蛋白表达（n=4，x±s）

注：*：与正常组相比，P＜0.05；#：与模型组相比，P＜0.05。

与正常组相比，PAN作用于人足细胞后，导致nephrin及podocin蛋白表达的下降，而应用不同浓度的黄芪多糖后，两者表达均上升，虽然只有高浓度组的蛋白表达与模型组相比有统计学差异（P＜0.05），但仍可以看出这种蛋白表达的上升呈浓度依赖性，而溶剂对照组的蛋白表达与模型组基本没有差异（P＞0.05）。这一实验结果证明，PAN确实能造成人足细胞裂孔膜的损伤，而黄芪多糖对其有修复作用。

同时，与正常组相比，模型组中PKC、JNK及p38的蛋白表达均有上升，且有统计学差异（P＜0.05），且在黄芪多糖处理后三者的蛋白表达均趋于正常组，其中PKC、JNK及p38的蛋白表达与模型组相比在中剂量组时即有统计学差异（P＜0.05），总体而言，三种蛋白表达的改变均存在浓度依赖性，这与nephrin及podocin的表达量改变呈正相关，故可认为PKC/MAPK通路确实参与了黄芪多糖对损伤人足细胞裂孔膜的修复。

3  讨论

PAN肾病模型最早表现为大量蛋白尿，其病程进展反映了由足细胞损伤所致的微小病变和局部病灶节段性肾小球硬化的典型过程。^[5]现代医学认为肾小球基底膜（glomerular basement membrane,GBM）通透性的改变是蛋白尿产生的基本原因，而足细胞作为肾小球基底膜的最外层，已有研究表明，其能预测蛋白尿的发生^[6]。Nephrin是足细胞足突上的一种跨膜蛋白，相邻足突的nephrin分子之间相互作用，形成“拉链状”结构，成为裂孔膜的主要构架分子。各种原因造成的npphrin移位表达下降和分子损伤都会影响足细胞内骨架蛋白的重排和相连蛋白的功能，导致足突形态变化、增宽融合，使屏障被破坏，血浆蛋白漏出，产生蛋白尿^[7]。Podocin则呈发夹样插入细胞膜，折叠处位于膜表面^[8]，胞内段可与nephrin与CD2相关蛋白（CD2-associated-protein,CD2AP）形成复合体，介导裂孔膜与足突细胞骨架相连，同时能使激酶的活化程度大大提高而明显增强nephrin诱导的信号转导作用。蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是一类由多种同工酶组成的钙磷依赖性的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶^[9]，受到外界刺激后PKC向细胞膜移动，并由于多种膜蛋白的磷酸化改变构象，可以识别和激活通路^[10]，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种信号传导过程。有一些证据表明PKC可能参与肾小球损伤和间质纤维化的病理过程^[11]。PKC是多种生物信号通路上游因子，其中MAPK链就是其下游的真核生物信号传递网络中的重要途径之一，哺乳动物体内已知5种不同的MAPK信号转导通路，p38及JNK信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用，有研究证明p38及JNK通路活化均可导致蛋白尿的发生^[12-13]。

PNS在传统医学中没有具体的病名，但可以归属于“水肿”、“尿浊”“阴水”等范畴，病属本虚标实，其最常见的临床表现为大量蛋白尿。中医认为“肺虚则气不化精而化水，脾虚则土不制水而反克，肾虚则水无所主而妄行，水不归经而横滥皮肤，渗于脉络”。认为蛋白是人体精微物质，为脾胃运化水谷而来，由肾脏固摄封藏。脾虚则运化升清乏能，转输无权，精微不布，导致清气下注膀胱；肾虚则开阖失司，水湿停聚，固摄无权，精气下泄，二者均可发为蛋白尿，因此治疗上当以“补肾益脾”为主^[14]。有研究表明，“补肾益气”能够调节T细胞亚群平衡，改善免疫反应^[15]。黄芪作为“益气”的代表药物，其具有补气健脾，升阳举陷，益胃固表，利尿消肿，托毒生肌等功效，而APS是黄芪中生物活性最高的成分，也是近年来研究最多的黄芪的有效成分之一，具有抗氧化^[16]、抗肿瘤^[17]、降血糖^[18]、抗动脉粥样硬化^[19]、抗衰老^[20]、调节免疫功能^[21]等作用，樊文星等^[22]亦通过实验证实黄芪多糖可以通过降低肾小球足细胞上Desmin的表达从而达到治疗蛋白尿的目的。

本研究结果显示，应用PAN刺激后，人足细胞裂孔膜上的nephrin及podocin的mRNA和蛋白表达均明显降低，表示PAN能造成足细胞裂孔膜与细胞骨架之间的结构破坏，导致滤过屏障功能减弱，这种改变在体内及可引起蛋白尿的发生，而给予不同浓度的黄芪多糖后，nephrin及podocin的mRNA和蛋白表达均有不同程度的上升，且表现为浓度依赖性，证明黄芪多糖对损伤的人足细胞裂孔膜具有修复作用，亦证明了“补益肾气”在治疗肾病综合征中的意义。但是黄芪多糖是通过什么作用机制而达到“补益肾气”的作用，是值得思考的。笔者在查阅文献及利用BATMAN-TCM分析黄芪多糖的潜在通路后，发现其作用机制可能与MAPK通路相关，且因直接参与通路作用的是相关蛋白，故本研究选择进一步检测各组中PKC、p38及JNK的蛋白表达量来探索PKC/MAPK通路是否参与其中。结果证明，损伤足细胞中的PKC、p38及JNK的蛋白表达呈下降趋势，而经黄芪多糖处理后表达渐趋正常，与nephrin及podocin的改变呈负相关，亦表现为浓度依赖性，故可以认为，PKC/MAPK通路参与了黄芪多糖修复损伤人足细胞的过程。

综上所述，PAN能够造成人足细胞裂孔膜的损伤，而黄芪多糖能修复这一损伤，且呈浓度依赖性，并且根据实验结果，推测PKC/MAPK通路参与这种修复作用，但是具体如何参与，哪些蛋白是关键因子仍不清楚，这也是我们后续研究的重点。但为基于对蛋白尿性肾脏疾病分子机制的认识，去开发研制新的能进行有效干预的药物治疗疾病提供了新的思路和方向。此次研究证明了“益气”药物在治疗PNS中的作用，亦表明“气虚”在PNS病程的发生发展中有着重要的意义，为中医药理论的正确性提供了现代医学的证据。

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