黄酮类化合物抗疲劳作用研究进展

 刘威良，黄艾祥

 （云南农业大学 食品科学技术学院 云南 昆明 650201）

 文章已被食品研究与开发杂志社录用，食品研究与开发杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/shipinyanjiuyukaifa

摘要：黄酮类化合物是一类多酚类物质广泛存在于植物中，具有广泛的抗疲劳、抗肿瘤、免疫调节等药理和生理活性。文章阐述了疲劳产生的机制，介绍了黄酮类化合物提取、分离和结构鉴定及其生物活性，列举了2个黄酮类抗疲劳的功能活性成分，并对其研发抗疲劳功能性食品及其保健品进行展望。

关键词：疲劳；黄酮类化合物；功能活性成分；抗疲劳功能性食品；保健品

Present Situation in Research of Anti-fatigue effect of Flavonoids

LIU Wei-liang¹ ,HUANG Ai-xiang^2*

(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming ,Yunan  650201)

Abstract: Flavonoids compound was one of Phenolic substances, which exist extensively in the plant kingdom. It has some important pharmacological and physiological activity such as anti-fatigue, anti-cancer, Immunomodulatory and so on. The paper ascertain mechanism of fatigue, introduced the structure and the technology of flavonoids’s extraction and separation and physiological activities, listed two anti-fatigue active ingredients of the flavonoids, then prospect its development and utilization in the area of anti-fatigue functional food and health products.

Key words: fatigue; flavonoid’s compound; functional active ingredient; anti-fatigue functional food; health products

疲劳是指体力或脑力到达一定阶段时必然出现的一种正常生理现象，从中枢神经系统至骨骼肌细胞再到细胞内物质代谢过程，是机体复杂的生理变化过程，中间任何一过程或环节综合变化都可导致疲劳的产生^{[1, 2]}。疲劳是普遍存在的一种生理现象，但人们对其认识在不断加深，1880年莫桑首次提出“疲劳”的概念^[3]，而后人们根据属性不同，将疲劳分为生理性和病理性疲劳。若能通过适当的休息缓解或者消除疲劳者,属生理性疲劳；不能通过休息或者药物解除并且导致实质性损害者,属病理性疲劳。Toshihiko^[4]将疲劳分为4大类型：①运动性疲劳；②中枢性疲劳；③热环境引起的环境疲劳；④免疫引起的疲劳。而黄林章等^[4]把疲劳分为外周和中枢疲劳两大类。外周疲劳主要是指肌肉的疲劳，表现为肌肉酸疼，肌肉力量下降，动作迟缓，协调能力下降不灵敏等；中枢疲劳简单的讲就是由于过度运动后脑组织中5-羟色胺、γ-氨基丁酸等神经递质含量发生改变，从而影响中枢神经系统的兴奋与抑制的动态平衡过程，从而导致中枢疲劳。现代人工作学习压力大，生活节奏快，身体处于亚健康状态，很容易出现疲劳，造成工作学习效率低，而且渴望得到缓解，尤其在运动界、高原和一些井下工作的特殊人员更需要克服疲劳。具有抗疲劳的化学药物多为大脑皮层兴奋药物，在大脑皮层处于抑制状态时这类药物作用就更为显著，此类药物主要抗疲劳作用为兴奋大脑、消除睡意，可使服用者保持较长时间的连续工作状态，其代表药物有咖啡因、苯丙胺、利他林、甲氯芬酯、吡拉西坦、莫达非尼，但这些抗疲劳化学药物多具有成瘾性，副作用大使临床应用受到限制^[5]。近年研究方向转向从一些药食同源植物中寻找抗疲劳物质成为热点。大量研究表明一些植物来源的活性成分如多糖^{[6, 7]}、皂苷^[8-11]、黄酮^{[12, 13]}、生物碱^[14-17]、多酚^[18-20]等具有抗疲劳功能，为抗疲劳功能性食品的研发提供了物质基础。随着营养与运动医学交叉研究的不断深入，越来越多的实验证实植物来源化合物可影响机体的能量代谢，发挥抗疲劳作用。本文就近年来黄酮类化合物抗疲劳作用及其他药理活性研究进展进行综述。

1 疲劳产生机制

运动性疲劳产生的机制比较复杂，目前尚存不同的观点，近年来受到广泛认同的有以下几个假说。

1.1氧自由基-脂质过氧化学说

正常人在新陈代谢过程中，会产生大量反应氧族（Reative Oxygen Species，ROS），如一些羟基自由基、单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢等，它们可以与磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损伤肌细胞膜。过量的ROS积累会导致体内氧化还原系统失衡，从而引发细胞内蛋白质和核酸的氧化应激损伤，最终引起细胞凋亡和肌肉等组织器官功能损伤，进而导致疲劳的产生^[21-23]。自从Dillare首次将自由基引入运动医学领域，国内外学者针对自由基与运动之间相互影响进行了大量研究。于1982年Davies等^[24]首次应用电子自旋共振技术（ERS）直接证实了力竭运动后肌肉、肝脏中的自由基明显增多，从而表明运动是自由基大量生成的诱因之一。随后，众多动物和人体实验研究也表明，急性剧烈运动时，机体清除过量自由基的能力不足时，体内细胞处于氧化应激状态，从而导致细胞损伤，进而诱发疲劳的产生。有研究表明运动产生细胞氧化应激损伤的作用机制一般有黄嘌呤氧化酶机制和线粒体机制，最近又有学者提出了前列腺机制、中性粒细胞机制和钙机制^[25]。

1.2能源物质耗竭说

能量物质耗竭学说认为，当机体运动时对能源的需求增加，同时没得到及时补充，又由于有氧代谢能力不足，需通过无氧呼吸提供能量。运动的同时导致体内氧化与抗氧化系统失衡，阻碍了磷酸腺苷活化蛋白激酶( 5'-AMP-activated protein kinase，AMPK)的活性，以致使ATP的过度损耗和氧代谢产物（d-ROM）的过度产生，从而引发一系列生化反应，机体为了避免运动引起的损伤产生疲劳反应^{[26, 27]}。从分子水平上看，激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，使过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活剂-1( PGC-1) 基因的表达上调，进而增加线粒体的生成；在组织水平上，骨骼肌血管内皮生长因子A（VEGF-A）增加的同时，凝血栓蛋白-1（TSP-1）减少，以致骨骼肌毛细血管增生，产生肌肉功能障碍，运动能力下降，最终引发疲劳^[28-30]。

1.3 致劳物质蓄积学说

大量数据说明^[31]，机体在运动过程中肌肉收缩时，由于营养物质的分解会产生乳酸、丙酮酸和氨堆积，机体清除系统无法及时将其分解成更小分子，导致内环境的改变，如体内酸碱平衡、渗透压平衡、离子分布等失调，影响机体的正常代谢，失去原有运动力，从而导致疲劳产生。在高强度运动时机体为了提高能量供应，会消耗大量糖类物质与此同时氧气的供应不足糖酵解作用大量进行，生成大量乳酸，致使pH值在肌肉中下降，即肌肉中的氢离子浓度升高，加速疲劳感的产生^[32]。

1.4大脑皮层的神经保护性抑制学说

大量运动时，随着能源物质的消耗，机体内环境紊乱，控制运动中枢的大脑皮层会产生一系列的反应来保护机体免受进一步损伤，即剧烈运动时，大量神经冲动传到大脑皮层相应神经元，该神经元会长时间处于兴奋状态，为避免其过度损耗，机体产生抑制冲动，导致运动能力下降，产生疲劳反应^[33]。目前对中枢抑制导致疲劳的研究较少，一些生物学机制已经阐述了中枢性疲劳。研究数据表明脑内5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量的增加与减少会加速或延迟疲劳的发生。其他一些神经调控因子如氨分子和炎性细胞因子，这些物质可以降低运动的耐受力，血液里和脑组织中氨含量的升高也会造成大脑皮层的抑制，最终导致疲劳。持续运动时疲劳受外界因素和复杂的大脑皮层抑制综合作用^[34]。

2 黄酮类化合物的提取、分离及其结构鉴定

2.1 提取

首先黄酮类化合物系色原烷或色原酮的衍生物，主要是指以2-苯基色原酮为母核的化合物，是一类重要的植物化学成分^[35]。现在则泛指2个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物（C₃-C₆-C₃），又由于这类化合物大多呈淡黄色或黄色，因此称为黄酮^[36]。黄酮类化合物资源丰富且易于提取，广泛存在于植物的茎、叶、花、果实等器官中，是一组在结构和性质上不同的多酚类物质，属于植物次级代谢产物，多以苷类或游离态形式存在于植物液泡中^{[37, 38]}。目前，植物总黄酮的提取一般采用溶剂提取法，通常用的溶剂有甲醇、乙醇、水或其他极性溶剂。除此之外还有以下提取方法：

2.1.1 超滤法

黄酮类化合物的分子量多在1kDa以下，而多糖、蛋白等其他其分子量多在50kDa以上，采用超滤法可以去除这些杂质，提高药液有效成分含量和澄清度，而且在分析过程中准确性高，重复性好。张效林等^[39]用超滤法提取侧柏叶总黄酮时，有效的将脂溶性叶绿素和鞣质分开。王羡一等^[40]采用均质法和超滤膜法从侧柏叶中获得高纯度的黄酮成分。

2.1.2 超临界流体萃取法

该方法是通过控制临界温度和压力达到选择性提取和分离目的，利用某种液体在临界点附近某区域内具有流动性好、溶解能力强及传递性能高等特点^[41]。目前常用的超临界流体是CO₂，与传统方法相比，此技术工艺简单、提取效率高、无溶剂残留、且低温可以保护热敏性成分^[42-44]。有研究表明，超临界流体萃取中，不仅可以用CO₂单一流体作为萃取剂萃取一些极性低的游离黄酮类或黄酮苷类，还可以加入乙醇作夹带剂萃取一些极性偏高的黄酮类成分^[45]。Petra Kotnik等人利用超临界CO₂萃取从甘菊花中提取 a-红没药醇、母菊素等，这与传统法相比体现出好多优点^[46]。但也有一些不足之处如溶剂选择范围窄、投资成本和设备要求高。

2.1.3 超声辅助提取法

超声波提取法是利用超声波产生的机械效应、扩散、热传递以及空化作用加强细胞内物质的释放，从而加速植物中有效成分的扩散和浸出。超声波的频率指在20-35kHz范围内的声波^[47]。随着科学技术的快速发展，超声提取技术已经广泛用于中草药等植物活性成分的提取中，其具有提取时间短、有效成分溶出高、成本低、低温保护热敏感成分及污染小等优点^[48]。张晓旭等^[49]采用70%乙醇，60℃超声提取3小时后，通过响应面优化杜仲叶总黄酮的沉淀分离工艺。Ali Ghasemzadeh等^[50]采用超声辅助提取咖喱叶中黄酮类化合物并运用响应面法对其提取工艺进行优化，且对黄酮类化合物的药理活性进行了研究。Y Wu 等^[51]也通过超声辅助提取土荆芥黄酮类化合物，并应用响应面技术对其工艺进行优化。

2.2 分离与纯化

2.2.1 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（HSCCC）是一种连续高效的液-液分配色谱技术，它是利用两相溶剂体系，在高速旋转的螺旋管内建立起来的一种特殊的单相流体动力学平衡，并实现高效分配、传递依次洗脱达到分离的目的^[52]。黄酮类化合物作为一类具有多种生物活性的化合物，其利用此技术分离纯化制备已知黄酮类化合物的报道较多，这为以后生物学实验、药理学实验和临床药效学研究提供足够的样品^[53]。Xiao等通过两步分离纯化从黄芪中得到5种黄酮苷类化合物，纯度达到90%以上^[54]。Peng等用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为两相溶剂从白花败酱草中分离纯化了3种黄酮类化合物，其纯度达到99.2%。这些实验都显示出此技术高效强大的分离纯化能力。

2.2.2 柱色谱法

分离纯化黄酮类化合物常用的柱色谱吸附剂或载体有硅胶柱、纤维素粉、葡聚糖凝胶、活性炭、氧化铝和硅藻土等^[55]。

2.2.3 双水相萃取

双水相萃取技术是上世纪60年代提出的，90年代用于天然产物的分离纯化。此法属于液-液萃取，根据待分离成分在两相间的选择性分配，使其分离。其特点是条件温和、操作简便、安全方便、无污染、价格低廉、萃取率高等，因此成为黄酮类化合物富集分离的一种有效方法，已经在黄酮类化合物分离纯化上得到应用^[56-58]。

2.3 结构鉴定

2.3.1 平面色谱法

平面色谱法包括纸色谱法和薄层色谱法。K Pozsonyi^[59]等用薄层色谱法比较了自然生长条件下和人工栽培的变种中洋地黄叶子里的洋地黄苷的含量差异。

2.3.2 高效毛细管电泳（HPCE）法

Pietta等^[60]用MECC法在紫外线二极管阵列检测方法下分析测定了蜡菊属植物中的黄酮类化合物，并对其结构化学组成进行了鉴定。M. A. Aremendia ^[61]等用CZE法结合电喷雾质谱分析方法分离了几种不同的黄酮类化合物，并对其结构进行了鉴定。

2.3.3 高效液相色谱法

黄酮类化合物的分析普遍使用C₁₈柱。Fang fang^[62]等用该方法研究了红葡萄酒中十余种黄酮类化合物如毛地黄酮、杨梅酮、桑色素等。目前样品水解后采用HPLC方法测定总黄酮含量是公认的好方法，另外色谱与质谱联用成为一种新的检测技术^[63]。

2.3.4 紫外分光光度法

此法利用样品在溶解后，与化学试剂作用生成颜色反应，在特定波长处有特异性吸收，操作简便、快速，目前应用较广泛。程研等^[64]人利用此法建立黄芪中总黄酮的含量测定方法,比较不同产地黄芪药材总黄酮的含量。梁欣洛^[65]等人采用紫外分光光度法测定了黄芪总黄酮的含量，并对此法进行了探讨。

3 黄酮类化合物生物活性功能

3.1 抗氧化及清除自由基作用

自由基被认定为引起心血管、癌症、衰老等退变性疾病的罪恶之源，大量研究表明黄酮类化合物具有很强的清除自由基和抗氧化能力。Sandra R^[66]等人用化学荧光法对不同类黄酮化合物进行了分析检测，确定了它们的抗氧化能力。研究发现，黄酮类化合物在抗氧化反应中既能清除链引发阶段的自由基，也可以直接捕获反应链中的自由基，阻断其链反应，起到预防和免断链双重作用^[67]。

3.2 免疫调节作用

生物类黄酮具有抗炎作用，其抗炎机制可能在于抑制前列腺素（PG）生物合成过程中的脂氧化酶（LOX）。Selleri^[68]等1995研究发现，慢性炎症疾病通常伴有氧自由基和NO含量升高现象，金雀异黄素作为酪氨酸激酶的抑制剂，可以起到一定的抑制NO形成的作用。周月蝉等^[69]研究表明，在连续30天灌胃小鼠适量藤茶，发现藤茶总黄酮可以提高小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能。黄酮类化合物对免疫系统的调节呈现多样性由于作为实验材料的一般是总黄酮，其成分复杂具体是哪类单一成分起作用，机制不太明确有待进一步研究。

3.3 抗疲劳作用

黄酮类化合物是自然界存在的一种天然抗氧剂，亦称维生素P，诸多文献表明其具有很强的抗氧化活性。运动性疲劳是由诸多因素所引起，但大多数人都同意其与自由基的过度积累有关，所以除了增加能源物质的补充，有效的补充黄酮类外源抗氧剂也是一种重要手段。槲皮素( quercetin)及其苷类为植物界分布最广的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌防癌、抗菌抗病毒等作用能参与细胞凋亡、细胞周期复制、解毒和血管生成等生物过程，最近有研究表明槲皮素对实验动物有较好的抗疲作用^[70]。芦丁是广泛存在于自然界中的一类黄酮类物质，大量研究已表明其具有抗氧化、抗炎、抗衰老、降血压等药理作用。吴涛^[71]等人通过小鼠负重游泳等实验证明芦丁具有很好的抗运动性疲劳作用。总之黄酮类化合物在体内发挥抗疲劳作用可能是单一靶点或多靶点相互作用，其机制需要生深入研究，为其开发成为抗疲劳保健食品提供实验基础。

4 展望

黄酮类化合物的医疗保健功效日益得到人们认可，其开发利用已成为功能性食品、保健品、医药等领域的重要研究方向。深化黄酮类化合物的抗氧化、抗疲劳活性研究，将有助于进一步开发其在抗运动性疲劳食品保健方面的应用前景，带来更大的社会效益和经济效益。该类化合物在人体不能直接合成，只能从食物中获得，这就使得学者们更加关注于从绿色植物中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分^[72]。尽管黄酮类化合物的研究是一热点，但其在体内代谢吸收机制、抗疲劳等功能活性机制及其功能活性成分的确定有待进一步完善。

参考文献：

[1] 张颖捷, 杜万红. 国内外抗疲劳研究进展 [J]. 实用预防医学, 2012, 19(7): 1112-6.

[2] SUTHERLAND I A, FISHER D. Role of counter-current chromatography in the modernisation of Chinese herbal medicines [J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(4): 740-53.

[3] 鞠丽丽, 黄恬. 运动性疲劳的生化机制与恢复方法的综述 [J]. 当代体育科技, 2015, (35): 232-3.

[4] WATANABE Y, EVENGåRD B, NATELSON B H, et al. Fatigue Science for Human Health [J]. Springer, 2008,

[5] 徐志刚. 抗疲劳药物的研究进展 [J]. 海峡药学, 2012, 24(1): 21-3.

[6] TANG W, JIN L, XIE L, et al. Structural Characterization and Antifatigue Effect In Vivo of Maca ( Lepidium meyenii Walp) Polysaccharide: Structural characteristics and antifatigue effect of MP… [J]. Journal of Food Science, 2017, 82(3):

[7] LI J, SUN Q, MENG Q, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharide fractions from Lepidium meyenii Walp. (maca) [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 95(1305).

[8] ZHUANG C L, MAO X Y, LIU S, et al. Ginsenoside Rb1 improves postoperative fatigue syndrome by reducing skeletal muscle oxidative stress through activation of the PI3K/Akt/Nrf2 pathway in aged rats [J]. European Journal of Pharmacology, 2014, 740(14): 480-7.

[9] 王宁, 马慧萍, 漆欣筑, 等. Nrf2-ARE信号通路在机体氧化应激损伤防护中的研究进展 [J]. 解放军医药杂志, 2015, 27(12): 21-7.

[10] LEE Y J, JEONG H Y, KIM Y B, et al. Reactive oxygen species and PI3K/Akt signaling play key roles in the induction of Nrf2-driven heme oxygenase-1 expression in sulforaphane-treated human mesothelioma MSTO-211H cells [J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 2012, 50(2): 116-23.

[11] W T, Y Z, J G, et al. The anti-fatigue effect of 20(R)-ginsenoside Rg3 in mice by intranasally administration [J]. Biological & pharmaceutical bulletin, 2008, 31(11): 2024.

[12] KUO Y H, TSAI W J, LOKE S H, et al. Astragalus membranaceus flavonoids (AMF) ameliorate chronic fatigue syndrome induced by food intake restriction plus forced swimming [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 122(1): 28-34.

[13] LI C, ZHANG L. In vivo anti-fatigue activity of total flavonoids from sweetpotato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] leaf in mice [J]. Indian J Biochem Biophys, 2013, 50(4): 326-9.

[14] CORDELL G A, ARAUJO O E. Capsaicin: identification, nomenclature, and pharmacotherapy [J]. Annals of Pharmacotherapy, 1993, 27(3): 330.

[15] KIM K M, KAWADA T, ISHIHARA K, et al. Increase in Swimming Endurance Capacity of Mice by Capsaicin-induced Adrenal Catecholamine Secretion [J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 1997, 61(10): 1718.

[16] LIU Y, LIU C. Antifatigue and increasing exercise performance of Actinidia arguta crude alkaloids in mice [J]. Journal of Food & Drug Analysis, 2016, 24(4): 738-45.

[17] LI Y F, CHEN M, WANG C, et al. Theacrine, a purine alkaloid derived from Camellia assamica var. kucha , ameliorates impairments in learning and memory caused by restraint-induced central fatigue [J]. Journal of Functional Foods, 2015, 16(472-83).

[18] 王光军. 茶多酚对运动抗疲劳作用的分析研究 [J]. 福建茶叶, 2016, 38(3): 39-.

[19] FAN L, ZHAI F, SHI D, et al. Evaluation of antioxidant properties and anti-fatigue effect of green tea polyphenols [J]. Scientific Research & Essays, 2011, 6(13): 6102-5.

[20] SUGITA M, KAPOOR M P, NISHIMURA A, et al. Influence of green tea catechins on oxidative stress metabolites at rest and during exercise in healthy humans [J]. Nutrition, 2015, 32(3): 321-31.

[21] REID M B. Free radicals and muscle fatigue: Of ROS, canaries, and the IOC [J]. Free Radical Biology & Medicine, 2008, 44(2): 169.

[22] RR B, CA P. Clinical review: oxygen as a signaling molecule [J]. Critical Care, 2010, 14(5): 234.

[23] ATHANASIOS V, THOMAIS V, KONSTANTINOS F, et al. Pulmonary Oxidative Stress, Inflammation and Cancer: Respirable Particulate Matter, Fibrous Dusts and Ozone as Major Causes of Lung Carcinogenesis through Reactive Oxygen Species Mechanisms [J]. International Journal of Environmental Research & Public Health, 2013, 10(9): 3886-907.

[24] DAVIES K J A, QUINTANILHA A T, BROOKS G A, et al. Free radicals and tissue damage produced by exercise [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1982, 107(4): 1198.

[25] GOLDFARB A H. Nutritional antioxidants as therapeutic and preventive modalities in exercise-induced muscle damage [J]. Canadian journal of applied physiology Revue canadienne de physiologie appliquee, 1999, 24(3): 249.

[26] QUAN L, WANG Y, CAI G, et al. Antifatigue Activity of Liquid CulturedTricholoma matsutakeMycelium Partially via Regulation of Antioxidant Pathway in Mouse [J]. Biomed Research International, 2015, 2015(4): 1-10.

[27] KONO M, TATSUMI K, IMAI A M, et al. Inhibition of human coronavirus 229E infection in human epithelial lung cells (L132) by chloroquine: Involvement of p38 MAPK and ERK [J]. Antiviral Research, 2008, 77(2): 150-2.

[28] HüTTEMANN M, LEE I, PERKINS G A, et al. (−)-EPICATECHIN IS ASSOCIATED WITH INCREASED ANGIOGENIC AND MITOCHONDRIAL SIGNALING IN THE HINDLIMB OF RATS SELECTIVELY BRED FOR INNATE LOW RUNNING CAPACITY [J]. Clinical Science, 2013, 124(11): 663-74.

[29] KONDO M, YANASE S, ISHII T, et al. The p38 signal transduction pathway participates in the oxidative stress-mediated translocation of DAF-16 to Caenorhabditis elegans nuclei [J]. Mechanisms of Ageing & Development, 2005, 126(6-7): 642.

[30] HERZIG S, LONG F, JHALA U S, et al. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1 [J]. Nature, 2001, 413(6852): 179-83.

[31] 谈智武, 秦丹. 抗疲劳功能成分研究进展 [J]. 中国食物与营养, 2009, (5): 54-6.

[32] BAKER J, BROWN E, HILL G, et al. Handgrip contribution to lactate production and leg power during high-intensity exercise [J]. Medicine & Science in Sports & Exercise, 2002, 34(6): 1037-40.

[33] 王雪芹. 鲐鱼多肽的抗氧化活性与抗疲劳作用研究 [D]; 中国科学院研究生院(海洋研究所), 2014.

[34] DAVIS J M, BAILEY S P. Possible mechanisms of central nervous system fatigue during exercise [J]. Med Sci Sports Exerc, 1997, 29(1): 45-57.

[35] XU Y C, LEUNG S W, YEUNG D K, et al. Structure-activity relationships of flavonoids for vascular relaxation in porcine coronary artery [J]. Phytochemistry, 2007, 68(8): 1179-88.

[36] 董彩军, 李锋. 黄酮类化合物的研究进展 [J]. 农产品加工:学刊, 2010, 2010(2): 65-9.

[37] PIETTA P G. Flavonoids as antioxidants [J]. Journal of Natural Products, 2000, 63(7): 1035.

[38] HOLLMAN P C, KATAN M B. Dietary flavonoids: intake, health effects and bioavailability [J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 1999, 37(9-10): 937.

[39] 张效林, 薛伟明, 王康, 等. 侧柏叶乙醇提取液的超滤膜精制过程研究 [J]. 现代化工, 1998, (7): 22-6.

[40] 王羡一, 李瑞海, 贾天柱. 均质法联合超滤膜纯化侧柏叶黄酮成分的方法初探 [J]. 中国药师, 2017, 20(4): 661-3.

[41] CAVERO S, GARCíA-RISCO M R, MARíN F R, et al. Supercritical fluid extraction of antioxidant compounds from oregano : Chemical and functional characterization via LC–MS and in vitro assays [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2006, 38(1): 62-9.

[42] LIU C M, ZHAO J M, HONG-MEI L I, et al. Supercritical Fluid Extraction of Total Flavonoids from Leaves of Acanthopanax Senticosus Harms [J]. Chemical Research in Chinese Universities, 2007, 23(2): 233-6.

[43] REVERCHON E, MARCO I D. Supercritical fluid extraction and fractionation of natural matter [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2006, 38(2): 146-66.

[44] CHIU K L, CHENG Y C, CHEN J H, et al. Supercritical fluids extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2002, 24(1): 77-87.

[45] BAHRAMIFAR N, YAMINI Y, SHAMSIPUR M. Investigation on the supercritical carbon dioxide extraction of some polar drugs from spiked matrices and tablets [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2005, 35(3): 205-11.

[46] KOTNIK P, ŠKERGET M, KNEZ Ž. Supercritical fluid extraction of chamomile flower heads: Comparison with conventional extraction, kinetics and scale-up [J]. Journal of Supercritical Fluids, 2007, 43(2): 192-8.

[47] LEE M H, LIN C C. Comparison of techniques for extraction of isoflavones from the root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized solvent extractions [J]. Food Chemistry, 2007, 105(1): 223-8.

[48] 钱俊臻. 黄酮类化合物提取方法的研究进展 [J]. 自动化应用, 2008, (6): 35-7.

[49] 张晓旭, 欧阳玉祝, 李雪峰, 等. 响应面优化杜仲总黄酮的沉淀分离工艺 [J]. 应用化工, 2015, (6): 1050-3.

[50] GHASEMZADEH A, JAAFAR H Z, KARIMI E, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoid compounds and their pharmaceutical activity from curry leaf (Murraya koenigii L.) using response surface methodology [J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine, 2014, 14(1): 318.

[51] WU Y, HU H B, WANG C L, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids compounds from Chenopodium hybridum L. stem with response surface methodology; proceedings of the IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, F, 2016 [C].

[52] ITO Y. High-speed countercurrent chromatography [J]. Analytical Chemistry, 1995, 67(17): 3069-74.

[53] MARSTON A, HOSTETTMANN K. Developments in the application of counter-current chromatography to plant analysis [J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1112(1): 181-94.

[54] XIAO W, HAN L, SHI B. Isolation and purification of flavonoid glucosides from Radix Astragali by high-speed counter-current chromatography [J]. Journal of Chromatography B, 2009, 877(8–9): 697-702.

[55] HAVSTEEN B H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids [J]. Pharmacology & Therapeutics, 2002, 96(2–3): 67-202.

[56] ZHANG D Y, ZU Y G, FU Y J, et al. Aqueous two-phase extraction and enrichment of two main flavonoids from pigeon pea roots and the antioxidant activity [J]. Separation & Purification Technology, 2013, 102(102): 26-33.

[57] XUE-JUN S U, WANG Y, GAO R R. Research on the Separation of Rice Hull Flavonoids by Aqueous Two-phase Extraction [J]. Chemistry & Adhesion, 2017,

[58] SHAO S J, WEI J L. Study on the extraction of total flavonoids from Pine Pollen in PEG400/(NH_4)_2SO_4 aqueous two-phase system [J]. Science & Technology of Food Industry, 2017,

[59] POZSONYI K. The study of flavonoids and glycosides in the Digitalis lanata [J]. Proceedings of the 7th Hungarian Congress on Plant Physiology, 2002,46(3-4):253-254..

[60] PIETTA P, MAURI P, FACINO R M, et al. Analysis of flavonoids by MECC with ultraviolet diode array detection [J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 1992, 10(10-12): 1041-5.

[61] ARAMENDIA M A, GARCíA I, LAFONT F, et al. Determination of isoflavones using capillary electrophoresis in combination with electrospray mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A, 1995, 707(2): 327-33.

[62] FANG F, LI J M, PAN Q H, et al. Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging [J]. Food Chemistry, 2007, 101(1): 428-33.

[63] LIANG X. LC-MS/MS determination of naringin, hesperidin and neohesperidin in rat serum after orally administrating the decoction of Bulpleurum falcatum L. and Fractus aurantii [J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2004, 34(1): 159-66.

[64] 程研, 闵会, 何厚洪, 等. 紫外分光光度法测定不同产地黄芪总黄酮的含量 [J]. 江西中医药大学学报, 2015, 27(1): 58-60.

[65] 梁欣格, 吕卓红, 王盼盼, 等. 紫外分光光度法测定黄芪总黄酮含量 [J]. 亚太传统医药, 2016, 12(5): 35-6.

[66] GEORGETTI S R, CASAGRANDE R, DI M V, et al. Evaluation of the antioxidant activity of different flavonoids by the chemiluminescence method [J]. Aaps Pharmsci, 2003, 5(2): 111.

[67] 向丽, 周青, 叶亚新. La(Ⅲ)对UV-B辐射胁迫下大豆幼苗类黄酮清除自由基影响 [J]. 稀土, 2009, 30(1): 86-9.

[68] SELLERI C, SATO T, ANDERSON S, et al. Interferon-γ and tumor necrosis factor-α suppress both early and late stages of hematopoiesis and induce programmed cell death [J]. Journal of Cellular Physiology, 1995, 165(3): 538.

[69] 周月婵, 胡怡秀, 臧雪冰, 等. 藤茶安全性毒理学评价及其免疫调节作用实验研究 [J]. 实用预防医学, 2001, 8(6): 412-4.

[70] KASHYAP D, MITTAL S, SAK K, et al. Molecular mechanisms of action of quercetin in cancer: recent advances [J]. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine, 2016, 37(10): 12927-39.

[71] 吴涛. 芦丁抗疲劳作用的实验研究 [D]; 陕西师范大学, 2013.

[72] 王倩, 常丽新, 唐红梅. 黄酮类化合物的提取分离及其生物活性研究进展 [J]. 河北联合大学学报(自然科学版), 2011, 33(1): 110-5.