抑酸治疗对肺纤维化的实验研究

舒艳梅、杨兴娜、王金梁（通讯作者）

【摘要】目的 研究抑酸治疗对肺纤维化大鼠病情变化及转归的影响。方法 健康SD雄性大鼠36只，随机分为正常对照组（N组）10只，盐酸雷尼替丁组（A组）13只，醋酸泼尼松组（B组）13只。A、B组分别经鼻滴入博莱霉素诱导肺纤维化模型^[1-3]，N组经鼻滴入生理盐水。分别于造模后7d、14d随机处死A、B组大鼠1只，于造模后28天随机处死N组大鼠1只，A组、B组大鼠各2只，取肺组织行HE染色进行病理学检验，并取血清行丙二醛（malondialdehyde，MDA）的测定评价细胞损伤的程度，取动脉血行血气分析评估大鼠肺功能改变，验证造模是否成功。造模成功后，分别用盐酸雷尼替丁胶囊、醋酸泼尼松片、生理盐水对A、B、N组每天进行灌胃治疗，治疗28d后处死所有大鼠进行以上测定。结果 肺组织病理等级程度A、B组治疗有效率，经Fisher确切概率法检验，P＞0.05，两种治疗差异无统计学意义。与正常对照组相比，模型组MDA含量明显升高，差别有统计学意义（t=15.93，P＜0.01）。与治疗前相比，A组的MDA含量明显下降，差别有统计学意义（t=4.79，P＜0.01）。与治疗前相比，B组的MDA含量明显下降，差别有统计学意义（t=6.20，P＜0.01）。与B组相比，A组的MDA含量无明显差异（P＞0.05）。 PaO₂测定值在造模前后差异无统计学意义，在治疗前后差异无统计学意义（p＞0.05）。结论 1.博来霉素造模成功；2.抑酸治疗对肺纤维化大鼠的病情在一定程度上有所改善。

关键词：肺纤维化；抑酸治疗；博来霉素；盐酸雷尼替丁；醋酸泼尼松

Abstract:

Aim: Investigate the effect of the acid suppressor therapy and reverse on the pulmonary fibrosis rat model. Method:36 healthy male rats were randomly divided into 3    groups, including group N (10 rats) treated as the control group, group A (13 rats) treated with the ranitidine hydrochloride, group B (13 rats) treated with Prednisone acetate. The pulmonary fibrosis models were induced by using bleomycin to drip into the nasal cavity^[1-3],and the group N was treated with normal saline.1 rat in group A or group B was randomly sacrificed on the 7^th day and 14^th day after modeling . 1 rat in group N ,2rats in group A and 2 rats in group B were randomly sacrificed was randomly sacrificed on the 28^th day. To confirm the success of modeling ,the tissue sampled from the lung got HE stained and malondialdehyde in serum was measured .After confirmation, group A ,B,N were administered individually by ranitidine hydrochloride, Prednisone acetate and normal saline everyday .All rats were sacrificed and sampled on the 56^th day .Results :There is no Statistical difference in the therapy effects between group A and group B ,p>0.05,concluded by the degree of the pathology with Fisher Test. Compared with the control group, MDA’s level increased significantly ,t=15.93,p<0.01.The level of the MDA in group A significantly decreased after therapy ,t=4.79,p<0.01,and the level of MDA in group B decreased compared with pretherapy ,t=6.20,p<0.01.There was no significant difference between group A and group B ,p>0.05. Conclusion:1.The pulmonary fibrosis model was induced successfully.2.To some extent, the acid suppressor therapy made some effects on the pulmonary fibrosis rat model.

Keyword: pulmonary fibrosis; acid suppressor therapy; bleomycin; ranitidine hydrochloride; Prednisone acetate

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明的以进行性呼吸困难、运动耐力下降、肺实质的间质性浸润及肺换气功能受限( 限制性肺通气障碍) 为特征的慢性进展性纤维化性的特殊疾病；组织病理学和( 或) 影像学多显示为寻常型间质性肺炎(UIP) 表现^[4]，其发病率大约在3-6/10万人，也有研究发现，可能高达13-20/10万人,并呈上升趋势^[5]。IPF主要发生在中老年人，占肺间质疾病的20％～30％，逐渐进展，最终导致呼吸衰竭而死亡，被称为“不是癌症的癌症”^[6]。目前临床尚缺乏有效的防治方法，从确诊起，平均生存期仅2-3年,五年生存率不足40%^[7]，预后较差。

近年来，数项研究提示，多数IPF患者有异常的胃食管反流，异常的胃食管反流导致反复微吸入是IPF高危因素之一。但多数IPF患者为“隐性反流”，缺乏胃食管反流的临床症状，因此容易被忽略。随着24小时食管PH监测仪等先进仪器的使用，人们逐渐认识到胃食管反流可能对特发性肺纤维化的影响。2011年，Lee等^[8]对204个IPF患者进行回顾性研究发现抑酸治疗与延长 IPF患者的生存时间有关，至今尚没有抑酸治疗对IPF动物的实验研究。本实验将在病理、肺功能、血清学等方面研究抑酸治疗对肺纤维化大鼠病情的影响。

1. 材料与方法

1.1试剂 博来霉素针剂购自于河南天驰生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购自于南京建成公司；乌拉坦溶液及4％多聚甲醛溶液由河南科技大学动物实验室提供；盐酸雷尼替丁胶囊购自于阿特维斯制药有限公司（国药准字H44021231）；醋酸泼尼松片购自于哈药集团制药四厂（国药准字H23020185）。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立和分组 健康SD雄性大鼠36只，质量180~200 g(河南科技大学动物实验室提供)。通过抓阄的方式随机分为3组：正常对照组（N组）10只，抑酸治疗组（A组）13只，激素治疗组（B组）13只。A、B组一次性经鼻滴入博莱霉素（7μg/g）诱导肺纤维化模型，N组经鼻滴入生理盐水（7μg/g）。分别于造模后7d、14d随机处死A、B组大鼠1只，于造模后28天随机处死N组大鼠1只，A组、B组大鼠各2只，验证造模是否成功。

1.2.2 治疗方法 造模成功后，分别用盐酸雷尼替丁（30mg/kg/d）、醋酸泼尼松（6mg/kg/d）、生理盐水对A、B、N组每天进行灌胃治疗28d。

1.2.3取材及测定

1.2.3.1  肺组织病理检验 所有大鼠均采用乌拉坦腹腔注射麻醉后腹主动脉放血处死，开胸取肺组织，用生理盐水将肺组织漂洗数次，经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，进行HE染色病理组织检验。肺组织纤维化程度的判定：按Szapiel等^[9]的方法评价肺组织病理变化严重程度，具体分级标准见表₁。

表₁  肺组织病理变化严重程度分级标准

1.2.3.2  丙二醛（MDA）含量测定 取大鼠血清根据丙二醛（MDA）试剂盒说明书进行测定。

1.2.3.3  血气分析测定 取腹主动脉血行血气分析测定PaO₂。

1.2.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以`x±s表示，采用t检验；率的比较采用卡方检验，样本量＜40或理论数＜5时，用Fisher确切概率法检验。P＜0.05具有统计学意义。

2. 结果

2.1 肺脏大体观察结果

2.1.1  N组大鼠肺脏呈淡粉色，轮廓清晰，表面光滑，弹性正常，未见明显肿胀，无出血点。

2.1.2  造模7d、14d大鼠肺脏大体观未见明显异常；造模28d大鼠肺脏颜色变暗，部分区域呈灰白色，肺脏体积缩小，轮廓尚清晰，肺组织与胸膜可见部分粘连。

2.1.3  A组大鼠治疗过程第12d有1只大鼠死亡，28d后9只大鼠存活，其中有4只大鼠肺脏组织部分挛缩变形，部分呈片状或条索状灰白区，可见少量出血点，肺组织与胸膜可见部分粘连，其余5只大体观未见明显异常。

2.1.4  B组大鼠治疗过程第9d、11d、23d分别有1只大鼠死亡，28d后7只大鼠存活，其中有2只大鼠肺脏组织部分区域呈灰白色，可见少量条索样半透明区，其余5只大体观未见明显异常。

2.2 肺组织切片HE染色观察

2.2.1  N组肺组织结构正常，肺泡腔透亮，无明显充血水肿，肺泡壁薄，肺泡内未见明显渗出，未见明显急慢性炎性改变及纤维化表现，肺纤维化程度（－）。

2.2.2  造模7d后部分肺泡腔内可见少量渗出及炎细胞浸润，肺纤维化程度（＋）；造模14d后大鼠有较多的肺组织内可见炎细胞浸润和少量胶原沉积，肺纤维化程度（++）；造模28d后，肺组织内可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡间隔增宽，肺泡内有大量的成纤维细胞增生及胶原沉积，肺纤维化程度（+++）。

2.2.3  A组和B组肺泡炎和纤维化程度较治疗前均减轻 见图₁。A组中10只大鼠，8只大鼠肺纤维化程度有所改善，1只死亡，1只无明显变化，有效率为89％。B组中10只大鼠，6只大鼠肺纤维化程度有所改善，2只死亡，1只无明显变化，有效率为86％。各组大鼠肺组织病理标本纤维化程度 见表₂。

N组肺组织              造模7d 肺组织        造模14d 肺组织

造模28d 肺组织      A组治疗28d 肺组织     B组治疗28d 肺组织

图₁大鼠病理HE染色图(4×10倍)

表₂ 各组大鼠肺组织病理标本纤维化程度

表₃两组治疗后有效率情况比较

注：经Fisher确切概率法检验，P＞0.05。两种治疗差异无统计学意义。

2.3血清MDA测定 各组大鼠治疗前后血清MDA的测定结果 见表₄。

表₄  各组大鼠治疗前后血清MDA含量的变化

注：#与N组比较，P＝0.000；*与模型组比较，P＝0.001；#*与模型组比较，P＝0.000；*与B组比较，P＝0.613。

与正常对照组相比，模型组MDA含量明显升高，差别有统计学意义（t=15.93，P＜0.01）。与治疗前相比，抑酸治疗组的MDA含量明显下降，差别有统计学意义（t=4.79，P＜0.01）。与治疗前相比，激素治疗组的MDA含量明显下降，差别有统计学意义（t=6.20，P＜0.01）。与激素治疗组相比，抑酸治疗组的MDA含量无明显差异（P＞0.05）。

2.4动脉血气分析 PaO₂ 测定

与正常对照组相比，模型组PaO₂下降，与治疗前相比，抑酸治疗组PaO₂升高，激素治疗组PaO₂下降，与激素治疗组相比，抑酸治疗组PaO₂升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3. 讨论

近年来，胃食管反流导致呼吸道症状的研究越来越多，其中有研究发现IPF存在胃食管反流病的高发现象，也有国内研究发现1例病程长达30余年的胃食管反流病引发的IPF患者^[10]。多项研究^[11-14]发现胃食管反流可能是IPF的潜在病因。这提示了抑酸治疗可能会在肺纤维化的治疗中起到一定的作用。

在肺纤维化的治疗中，糖皮质激素是治疗IPF的经典用药。糖皮质激素是一种强有效的免疫抑制剂，能抑制多种免疫效应细胞的功能，从而抑制各种细胞因子的合成与分泌^[15]，降低免疫复合物水平，从而减少IPF患者的肺泡炎症和纤维化，改善患者的临床症状^[16]。此外，糖皮质激素还可以通过选择性诱导肺内炎症细胞凋亡，减轻博莱霉素引起的肺泡炎和随之发生的间质肺纤维化^[17]。

盐酸雷尼替丁是一种常用的抑酸药物，用于缓解胃酸过多所致的胃痛、胃灼热感（烧心）、反酸。主要适应证：①消化性溃疡出血、弥漫性胃黏膜病变出血、吻合口溃疡出血、胃手术后预防再出血等；②应激状态时并发的急性胃黏膜损害，和阿司匹林引起的急性胃黏膜损伤；亦常用于预防重症疾病（如脑出血、严重创伤等）应激状态下应激性溃疡大出血的发生；③全身麻醉或大手术后以及衰弱昏迷患者防止胃酸反流合并吸入性肺炎^［18-19］。因此本实验选择醋酸泼尼松及盐酸雷尼替丁进行实验。

有回顾性研究显示，抑酸治疗与延长IPF患者的生存时间有关，但目前尚无前瞻性的研究。本研究以动物实验为基础进行单独的抑酸治疗，利用雷尼替丁具有防止吸入性肺炎这一作用为着手点进行抑酸治疗。

从肺病理组织学观察，模型组可见肺组织结构破坏，重度炎性细胞浸润，纤维组织增生实变，纤维化明显，提示造模成功。抑酸治疗组及激素治疗组，可见肺组织炎性细胞浸润减少，纤维组织增生减少，纤维化程度降低，提示抑酸治疗及激素治疗可以在一定程度上改善肺泡炎和肺纤维化的程度。

MDA是过氧化脂质的主要代谢产物，可反映机体内组织脂质过氧化程度，其含量的变化可以间接反映氧自由基含量，目前临床中认为能够评估体内氧化应激反应的程度，其含量增高，说明组织内脂质过氧化作用增强^［20-22］。血清中MDA值作为炎症指标，与肺细胞损伤呈正相关。本研究发现盐酸雷尼替丁和醋酸泼尼松均可降低其MDA值，且均具有统计学意义，两组治疗降低MDA值的程度无显著差异。

动脉血气氧分压作为评估肺功能的指标，本实验所得结果PaO₂值造模后有降低趋势，两组治疗后有升高趋势，但无统计学意义。此结果不除外由于本实验样本量小、观察时间短等局限性因素而致的偏倚，有待于进一步研究。

本研究由于受到实验条件和实验周期的限制，且样本量局限，可能无法全面反映造模以及各种的详细治疗情况，况且特发性肺纤维化本身发病机制错综复杂，多种因素参与并相互作用，还需要各种手段监测更多相关因子以验证抑酸治疗的对肺纤维化大鼠的影响。

综上所述，在肺纤维化大鼠的治疗上，盐酸雷尼替丁具有与醋酸泼尼松相似的改善肺纤维化的情况，可在一定程度上改善博来霉素所致肺纤维化的肺泡炎症，降低其血清中的炎症指标，在抗氧化抑制肺纤维化这一机制中起到一定作用，减轻肺纤维化程度。本实验虽不能完全证明抑酸治疗的效果，但通过本实验可以更好的为临床肺纤维化治疗的抑酸治疗提供初步的实验室数据。

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