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攀枝花和南昌地区耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的流行特征及耐药基因分析
谭福燕，胡雪飞， 庞载元
（1.攀枝花学院附属医院病理科；2. 南昌大学第一附属医院检验科：3.攀枝花市中心医院检验科）
文章已被中国热带医学杂志社录用，中国热带医学杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/zhongguoredaiyixue
摘要：目的 分析攀枝花和南昌地区耐碳青霉烯肠杆菌科细菌（CRE）的流行特征及耐药基因分布。方法 收集2013年1月至2016年12月攀枝花和南昌地区医院临床分离的62株CRE，采用全自动微生物分析系统进行菌株鉴定和药敏试验，采用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型，PCR电泳检测其耐药相关基因。结果 62株CRE主要分离自重症医学科，占比12.9%；主要标本来源为痰液、尿液、血液；分离自男性的CRE约为女性的两倍;分离自40岁以上人群的CRE所占比例最高,为80.6%。改良Hodge实验阳性有29株，阳性率为14.5%。PCR检测，共检出11株blakpc，3株blaNDM，2株blaVIM，1株blaOXA-48。 结论 CRE临床分布存在科室、标本来源、性别、年龄差异，攀枝花地区分离的CRE主要流行blakpc、blaNDM, 南昌地区主要流行blaKPC、 blaVIM、 blaOXA-48。
关键词 肠杆菌科细菌 碳青霉烯酶 耐药基因
基金项目： 江西省卫生厅课题，20133042
作者简介：谭福燕，（1995年－），女，本科 ,攀枝花学院附属医院，研究方向：临床微生物学检验及细菌耐药监测
通信作者*：胡雪飞，（1973-），主任技师，硕士，主要从事临床微生物检验及细菌耐药性监测，E-mail: hxf123666@sina.com
The analyse of epidemiological characteristics and drug resistant gene of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from Panzhihua and Nanchang
Tan Fuyan1, Hu Xuefei2*, Pang Zaiyuan3
(1. Department of Pathology,Affiliated Hospital of Panzhihua University; 2. Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang330006，Jiangxi，China；3. Department of Clinical Laborator,Panzhihua Central Hospital)
Abstract: Objective To analyze the epidemiological characteristics and drug resistance gene distribution of carbapenem-resistant enterobacteriaceae (CRE) from Panzhihua and Nanchang. Methods collecting 62 CREs isolated from Panzhihua and Nanchang from January 2013 to December 2016, The automatic microbial analysis system was used for strain identification and drug susceptibility test. The modified Hodge test was used to detect the carbapenemase phenotype. PCR amplification was used to detect resistance-related genes. Results 62 CRE was mainly isolated from the Department of Critical Care Medicine, accounting for 12.9%. The main specimens were sputum, urine and blood. The number of strains isolated from males was about twice that of females. The proportion of people over the age of 40 is the highest at 80.6%. There were 29 positive Hodge test positives with a positive rate of 14.5%. A total of 11 blakpc, 3 blaNDM, and 2 blaVIM,1 blaOXA-48 were detected by PCR. Conclusion CRE has significant differences in department, specimen source, gender and age. The CREs in Panzhihua area are mainly popular blakpc, blaNDM, and the main pop in Nanchang is blaKPC, blaVIM, blaOXA-48。
Key words Enterobacteriaceae;Carbapenemases; Resistance gene;
碳青霉烯类耐药肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae ，CRE）是指对美罗培南、亚胺培南、厄它培南任一抗菌药物耐药的细菌，可引起免疫力低下或衰弱患者的严重感染，导致其住院时间延长[1]。近年来，由于碳青霉烯类抗生素的使用增加，CRE呈广泛蔓延趋势，由于抗菌药物的使用受到药物供应、用药水平以及用药习惯的影响，细菌的耐药特征往往具有地域差异，因此，本研究对攀枝花和南昌地区CRE耐药基因的研究，有助于对临床抗感染治疗提供依据。
1.材料与方法
1.1菌株来源
收集2013年1月～2016年12月临床分离的62株CRE,其中10株分离自攀枝花市中心医院，52株分离自南昌大学第一附属医院（分离标本均为非重复菌株）。其中大肠埃希菌11株，产酸克雷伯菌1株，阴沟杆菌2株，弗劳地柠檬酸杆菌1株，肺炎克雷伯菌47株。标本分离自年龄为7天～86岁的人群，平均年龄51.85岁。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2仪器与试剂
VITEK-2 Compact全自动微生物分析仪、GN鉴定卡购自法国梅里埃公司，ABI7500 PCR仪，购自美国ABI公司；电泳仪、凝胶成像分析系统，购自美国BIO-RAD公司。Premix Taq、DNA marker购自日本TAKARA公司，引物由上海睿迪生物科技有限公司合成。
1.3改良Hodge实验
使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液调至0.5 麦氏浊度，1:10稀释后接种于Ｍ-Ｈ琼脂平板，干燥3-10分钟，在平板中心贴敷含10ul美罗培南的纸片，用接种环挑取3～5个待测菌株从纸片边缘向平板边缘划线，长度20～25mm，35℃,温箱孵育。若待测菌产碳青霉烯酶，其接种线与大肠埃希菌ATCC25922抑菌环交界处会产生向抑菌圈内增强生长的现象，即改良Hodge试验阳性；反之则为阴性。阳性质控株为Hodge(+)ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯菌，阴性质控菌株为ATCCBAA-1706。
1.4 DNA 模板制备
在2mlEP管中加入1ml蒸馏水，挑取2-3个菌落震荡混匀，沸水浴15min,12000r/min冷冻离心10-15min,取上清保留
1.5 琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增5种常见碳青霉烯酶基因，包括KPC基因、NDM、IMP、VIM、OXA-48基因。引物设计参照相关文献[2, 3]见表1，引物由上海睿迪生物科技有限公司合成。PCR反应体系总体积25 ul，包括DNA模板5ul，相应上、下游引物各1ul，2× Taq PCR masterMix 12.5ul，加无菌纯水至25ul， PCR扩增条件：95℃ 5min预变性；94℃ 40s变性，52℃退火40s，72℃ lmin延伸，共进行30个循环；72℃10min再延伸。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，用紫外凝胶成像与分析系统观察结果。
表1 基因引物序列
|
基因型 |
引物序列 |
片段长度 |
退火温度 |
|
5’-3’ |
(bp) |
℃ |
|
|
KPC |
正向：GTATCGCCGTCTAGTTCTGC 反向：GGTCGTGTTTCCCTTTAGCC |
638 |
56 |
|
NDM |
正向：GGTTTGGCGATCTGGTTTTC 反向：CGGAATGGCTCATCACGATC |
621 |
56 |
|
VIM |
正向：GATGGTGTTTGGTCGCATA 反向：CGAATGCGCAGCACCAG |
390 |
52 |
|
IMP |
正向：GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC 反向：GGTTTAAYAAAACAACCACC |
232 |
56 |
|
OXA-48 |
正向：TTGGTGGCATCGATTATCGG 反向：GAGCACTTCTTTTGTGATGGC |
744 |
52 |
2.结果
一、 CRE的临床分布
CRE的科室构成比中，重症医学科和NICU所占比例最大，均为12.9%；CRE主要分离自痰液、尿液；在性别分布中，分离自男性的标本数是女性的2.1倍；CRE主要分离自中老年人群。结果见表2。
表2 62株CRE的临床分布
|
临床分布 |
|
株数 |
构成比(%) |
|
科室分布 |
重症医学科 |
8 |
12.9 |
|
NICU |
8 |
12.9 |
|
|
神经外科 |
7 |
11.3 |
|
|
ICU |
7 |
11.3 |
|
|
烧伤科 |
4 |
6.5 |
|
|
其他 |
28 |
45.2 |
|
|
合计 |
62 |
100.0 |
|
|
标本分布 |
痰液 |
43 |
69.4 |
|
尿液 |
12 |
19.4 |
|
|
血液 |
4 |
6.5 |
|
|
分泌物 |
3 |
4.8 |
|
|
合计 |
62 |
100.0 |
|
|
性别分布 |
男性 |
42 |
67.7 |
|
女性 |
20 |
32.3 |
|
|
合计 |
62 |
100.0 |
|
|
年龄分布 |
<=18 |
5 |
8.1 |
|
18～40 |
7 |
11.3 |
|
|
>=40 |
50 |
80.6 |
|
|
合计 |
62 |
100.0 |
注：NICU：神经外科重症监护病房； ICU: 综合性重症监护病房
二、CRE的耐药性分析
CRE的耐药性结果见表3，CRE对哌拉西林/他唑巴坦以及碳青霉烯类抗菌素的耐药率均大于90.0%，呈现高耐药形式，对复方新诺明的耐药率最低，为50.0%。
表3 62株CRE对常用抗菌药物的耐药率
|
抗菌药物 |
株数 |
耐药率（%）） |
|
头孢哌酮/舒巴坦 |
59 |
78.0 |
|
哌拉西林/他唑巴坦 |
62 |
91.9 |
|
头孢唑啉 |
62 |
88.7 |
|
头孢曲松 |
62 |
87.1 |
|
头孢他啶 |
62 |
83.9 |
|
头孢吡肟 |
62 |
85.5 |
|
头孢噻肟 |
53 |
84.9 |
|
头孢西丁 |
53 |
77.4 |
|
氨曲南 |
62 |
83.9 |
|
厄他培南 |
62 |
93.5 |
|
亚胺培南 |
62 |
95.2 |
|
美罗培南 |
53 |
90.6 |
|
阿米卡星 |
62 |
74.2 |
|
庆大霉素 |
62 |
85.5 |
|
环丙沙星 |
62 |
83.9 |
|
左旋氧氟沙星 |
62 |
83.6 |
|
复方新诺明 |
62 |
50.0 |
|
四环素 |
40 |
80.0 |
三、碳氢酶烯表型
62株CRE中改良Hodge实验阳性的有29株，阳性率为14.5%，其中有2株改良Hodge实验阴性，但是KPC基因阳性。结果见图1。
注：（1）、（2）改良Hodge 试验结果阳性；（3）选取肺炎克雷伯菌ATCCBAA‐1705为阳性对照；（4）选取肺炎克雷伯菌ATCCBAA‐1706为阴性对照
图1. 改良Hodge试验
四、CRE耐药基因分布
经PCR检测结果见表4、图2，62株临床分离菌株中，共检出17株产碳青霉烯基因，攀枝花地区检出2株blaKPC，3株blaNDM,，其中一株同时携带blaKPC和blaNDM.南昌地区检出8株blaKPC，1株blaVIM，1株blaOXA-48，两地区均未检测到blaIMP。
表4 CRE的耐药基因分布
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KPC型 |
NDM型 |
IMP型
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