西北大学学报稿件信息
合浦珠母贝中foxl2基因的克隆与表达分析
尹秀娟1,齐晓辉1，张博2，邓正华 2，孙恒一1，李海梅
（1.潍坊医学院 生物科学与技术学院 潍坊 山东 261000 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 广州 510300）
摘要：叉头基因2（forkhead transcription factor gene2，foxl2）涉及到细胞分化和分裂调节，并在性别分化、维持等过程中发挥重要作用，但在合浦珠母贝中研究很少。该研究利用转录组数据克隆了合浦珠母贝（Pinctada fucata）foxl2基因，命名为Pffoxl2。该基因cDNA全长1742bp，开放阅读框（ORF）序列长度为1134bp，预测Pffoxl2基因编码的氨基酸为377个。编码蛋白包含一个成熟区FH功能结构域和成熟蛋白区。不同发育时期表达分析显示Pffoxl2差异表达于眼点期和变态附着期，提示其可能在眼点期开始出现分化。精子卵子表达分析显示其在卵子、精子中高表达，且显著高于其它发育时期，提示其可能与卵子、精子的发生具有密切关系。组织分析显示其在卵巢中高表达，且在性腺损伤实验中呈现差异表达。说明其在性腺分化尤其是卵巢发育中的重要作用。同时，组织表达分析显示其在珍珠囊中高表达，贝壳缺刻实验显示其表达水平在贝壳修复过程中呈现差异，表明该基因可能参与贝壳珍珠层的形成。该研究为Fox家族基因功能及合浦珠母贝性别分化机制研究提供参考。
关键词：合浦珠母贝；叉头基因foxl2；性别分化；缺刻实验
中图分类号：S533 文献标识码：A
Molecular cloning and expression analysis of foxl 2 gene from the pearl oyster, Pinctada fucata
YIN xiu-juan1, QI xiao-hui1, DENG zheng-hua2, SUN heng-yi1, ZHANG bo2, LI hai-mei1
（1. College of biology Science and Technology, Weifang Medical University, Weifang 261000, China; 2. Key Lab. of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Resource Exploitation and Protection Collaborative Innovation Center (SCS-REPIC), South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)
Abstract: Forkhead transcription factor gene 2 (Foxl2) have the function of including cell differentiation, division regulation, gender differentiation and maintenance belonging to the family of Forkhead/winged helix transcription factor family. But there are not much research about the Foxls in molluscs. The Foxl2 gene was cloned from the pearl oyster, Pinctada fucata and thus named as Pffoxl2 in the study. The full length cDNA of Pffoxl2 is 1742 bp, including an open reading frame (ORF) of 1134 bp encoding 377 amino acids. The sequence encoding protein contains Forkhead (FH) domain and a mature protein region. Pffoxl2 expressed higher in the eyespots stage and metamorphosis during the larval development as indicated by qPCR, suggesting that Pinctada fucata emerges gender differentiation from eyespots stage but unconspicuous. Compared with different development stages, the expression level is higher in sperm and egg especially in egg, which indicated that Pffoxl2 may participate in the oocytogenesis and spermatogenesis. Compared with other tissues, Pffoxl2 showed high relative expression level in gonad especially in ovary, and the ovarian injury test also illuminated that Pffoxl2 involved in the occurrence and repair of ovary. And also the relative expression level was higher in pearl sac suggesting Pffoxl2 may involve in the formation of nacreous layer of the shell and the shell notching experiment validated that point. The study provides some bases for the functional study of Fox family genes and the mechanism study of gender differentiation.
Key words: Pinctada fucata; foxl2; gender differentiation; shell notching experiment
性别分化程度决定物种的性别比例。决定有机体性别的遗传和/或环境过程[1],导致特异的分子级联反应将未分化的性腺分化为卵巢或精巢[2]。目前性别决定机制主要有三种：取决于遗传因素的性别决定机制（GSD）、取决于环境因素（ESD）的性别决定机制及两者共同效应决定机制[3]。性别决定在哺乳动物中已被广泛研究，且伴随有很多与性别分化有关的基因被挖掘，例如Wt1、Sf1、Sry、Sox9、Gata4、Dmrt 1和MIH，被证明与雄性发育相关[4]，而Wnt4、RSpo1、Foxl2和Dax1则对雌性的分化过程中具有重要影响[5]。
Foxl2（Forkhead box l2）基因高度保守，在脊椎动物中介导卵巢早期分化[6-8]。然而，foxl2基因在无脊椎动物中的研究却鲜少涉及[9-10]。Foxl2基因编码的蛋白质属于Forkhead/winged helix转录因子家族[11]。该家族基因具有保守的DNA结构域Forkhead box，功能涉及细胞分化和分裂调节[12]。在脊椎动物中研究发现，该基因在性别决定体系中呈现物种差异性，例如老鼠（Mus musculus）[13-14]，尼罗罗非鱼（Tilapia nilotica）[15]，鸡（Chicken）[16-17]和红耳滑鼠龟（red-eared slider turtle）[18], 但在大部分物种中，foxl2在胚胎体卵巢细胞中表达并在成体卵巢中保持表达状态[19-20]。在小鼠中，敲除foxl2基因或者同时敲除foxl2和wnt4[21]分别呈现出卵泡形成失败和完全的类睾丸结构XX性逆转。研究结果表明foxl2不仅决定雌性性腺分化，并且在性别分化后的整个生命过程中持续表达，维持性别[22]。Foxl2的作用在雌雄同体动物中同样具有保守性，例如雌性先熟群体，foxl2基因的表达量在从雌性到雄性的转化过程中呈现下降趋势[23]。据文献报道，在无脊椎动物中也存在foxl2的同源基因，在刺细胞动物海葵（Nematostella vectensis）中鉴定出NvFoxL2 [24]；海胆（Strongylocentrotus purpuratus）中发现SpFoxl2并在发育早期阶段前72小时大量表达[25]；海绵动物中发现Sd-FoxL2且在不同发育时期和组织中普遍表达[26]。所有研究均表明foxl2在性别分化中具有重要作用。
合浦珠母贝是重要的海水经济养殖物种，与其它珠母贝属如巴拿马珠母贝（Pinctada mazatlanica）、白珠母贝（Pinctada albino sugillata）、覆瓦珠母贝 （Pinctada imbricata）、射肋珠母贝（Pinctada radiata）和珠母贝（Pinctada margaritifera）相似，都具有雄性先熟、雌雄同体的特性，并具有相对稳定的性别组成[27-31]。前期转录组研究发现，合浦珠母贝中存在与foxl2高度同源的序列，该基因涉及贝类性别分化，而性别比例在合浦珠母贝养殖过程中具有重要意义，但到目前为止，并未存在合浦珠母贝性别分化相关的报道，因此，性别分化基因foxl2在合浦珠母贝中的表达特征更值得深入研究。该研究采用基因克隆的方法克隆foxl2基因cDNA序列，并利用荧光定量PCR的方法检测foxl2基因在不同发育时期、不同组织等中的表达，旨在探究foxl2基因在合浦珠母贝性别分化及性别维持方面的作用，为后期合浦珠母贝性别分化机制研究提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
实验所用动物合浦珠母贝由海南陵水养殖基地提供（南海水产研究所海南热带水产研究中心）。选取六只健康成贝（3雌3雄），放水泥池中暂养一周。此后对贝进行解剖，分别取8种组织：性腺(雌、雄)、珍珠囊、外套膜、闭壳肌、鳃、足、血液和肝胰腺。观察合浦珠母贝性腺，取成熟个体解剖取精、卵，部分至于液氮中保存，剩余部分用于体外受精，在光学显微镜观察，鉴别幼体发育时期，取精子、卵子及贝苗发育的担轮幼虫期、D-型幼虫期、壳顶幼虫期、眼点幼虫期、变态附着期分别取样。以上样品放入液氮中保存。
1. 2. 1 RNA的提取与cDNA的合成
取性腺，按传统Tirzol法（Invitrogen, USA）提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳（1%）检测完整性，紫外分光光度计用来检测提取的总RNA的纯度和浓度。检测合格后，用总RNA作为模板，利用反转录酶M-MLV（TaKaRa, 大连）合成cDNA第一条链，置于-20℃冰箱中保存备用。
本课题组测有合浦珠母贝转录组序列数据库，查找获得foxl2的cDNA片段。与其他物种foxl2基因经过多序列比对后，初步确定该基因的准确性。在此基础上，设计引物：S1/A1、S2/A2、S3/A3（表1），其中S1/A1和S3/A3分别用于验证两端已知序列，S2/A2用于扩增中间序列。1%琼脂糖凝胶回收扩增DNA片段，拼接检测的克隆测序，获得一条完整连续的序列。
表1 实验所用引物序列列表
Tab. 1 Sequences of primers used in the study
|
引物名称 primer name |
序列（5'→3'） Sequence (5'→3') |
用途 usage |
|
S1 |
TCTAAAACGCCGAACCGATGA |
序列验证 |
|
A1 |
TTTTACTGTCCAAAGGCTCA |
序列验证 |
|
S2 |
AATGAGCCTTTGGACAGTAA |
中间片段扩增 |
|
A2 |
ATCCGTAGTCGTTGAGTTGA |
中间片段扩增 |
|
S3 |
ACCCTCAACTCAACGACTACGG |
序列验证 |
|
A3 |
AACTTACTCCAAGCTGCTAT |
序列验证 |
|
qRT-S |
AAACCATCAATTATCCCGAGTG |
荧光定量 |
|
qRT-A |
CTGCGTGTTGCTGTCATCCT |
荧光定量 |
|
18S |
TGTCTGCCCTATCAACTTTC |
内参引物 |
|
18A |
TGTGGTAGCCGTTTCTCA |
内参引物 |
1. 2. 3 目的基因序列分析
利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）在线软件查找开放阅读框， Translate（http://web.expasy.org/translate）在线软件预测编码蛋白序列；用PortParam （http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）预测编码蛋白的理化性质；用TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）预测蛋白跨膜结构域；用Signal P （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白信号肽；用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode）分析蛋白功能结构域；利用DNAMAN和BioEdit进行同源序列比对。利用MEGA6.0软件构建进化树（Neighbor-joining（NJ）法）。
1. 2. 4 Foxl2在不同发育时期和不同组织的表达分析
扩增获得完整序列后，设计并合成实时荧光定量RT-PCR反应所用引物qRT-S/A（表1）。收集合浦珠母贝5个不同发育时期和9个组织（雌/雄性腺）各3个样品混合均匀后提取总RNA，用RT-PCR反转录试剂盒（TransGene, 北京）反转录获得cDNA。以合浦珠母贝18S rRNA为内参，用SYBR real-time PCR Master Mix（TransGene, 北京）进行qPCR反应。对每个组织和不同发育时期样品分别进行3次重复，分析其溶解曲线。基因相对表达水平计算采用2-ΔΔCt法。单因素方差分析软件用Origin8.0，差异显著阈值P<0.05。
1. 2. 5 性腺损伤修复实验
挑选32只健康雌贝，在水泥池中暂养，定期换水同时投放饵料，保持水质澄清。三天后取28只贝，排贝开口后用插核刀损伤性腺插核部位。处理后放回水泥池中，继续按之前方法喂养。另4只作为对照组不作处理。手术贝分别在处理后0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h各取4只。解剖取其性腺组织，提取总RNA，反转录后进行qPCR反应。方法同1. 2. 4。对照组做同样处理。对照组和处理组在每个取样点进行3次重复。
1. 2. 6 贝壳缺刻实验
取壳长约为8cm的健康成贝28只，暂养方法同1. 2. 5。三天后对随机挑选的24只成贝进行缺刻处理，方法参考Mount[32]的方法：在足对侧的贝壳处剪V型缺口，保证外套膜不受损的情况下破坏到珍珠层。讲缺刻处理后的贝放回原来的池子，继续饲养。另4只贝不做任何处理，为对照组。处理后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h各取4只处理贝。按照1. 2. 5的方法解剖，取外套膜提总RNA，反转录后进行RT-PCR，方法同1. 2. 4，对照组和处理组在每个取样点进行3次重复。
2 结果与分析
2. 1 目的基因cDNA序列分析
基因克隆获得Pffoxl2 cDNA全长为1742bp，开放阅读框（ORF）序列长度为1134bp，5’UTR 120bp, 3’UTR 488bp（GeneBank登录号：MH720276）。预测foxl2基因编码的氨基酸为377个，理论分子量为43.034kD，理论等电点为9.20。SMART结构域预测显示，Pffoxl2在137-2267aa处具有1个FH结构域。NetPhos 2.0 Server分析显示Pffoxl2有29个磷酸化位点，其中丝氨酸位点21个，苏氨酸位点2个，酪氨酸位点6个。PSORT II Prediction细胞定位显示foxl2基因位于细胞核（图1）。
通过DNAMAN软件将Pffoxl2蛋白成熟区与小家鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）等物种的foxl2蛋白对应序列进行比对，结果显示较高的一致性，成熟区FH功能结构域高度保守（图2）。选取人、长牡蛎等典型物种的foxl2蛋白序列构建系统进化树，结果显示聚类特征符合传统的物种进化分类，Pffoxl2蛋白和鸟类、两栖类、哺乳类、鱼类foxl2蛋白处于
1 CTTGTAATACACAGGAGAGTGATTTATGAGAAGTCGGATATTCTAAAACGCCGAACCGATGACGGACTAGATTTTTTTTTCCCGAAATTCATTTTAATATTTGTT
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1 M S E I D L R F K D V K L S E N M N F R I E N E E T L T E L
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66 S T C K Y G S K F G I A A R L E N N S G A K P K D D S N T Q N P K L K
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1681 AATGTATGCGCAGATCTAGACATTTAATCGATTTGACAACCTTATATAACATGTGGCCGACC
图1 Pffoxl2 基因cDNA序列及氨基酸序列示意图
注：左侧正常和加粗数字分别标明Pffoxl2基因cDNA序列和氨基酸残基位置。cDNA序列中方框内分别为起始和终止密码子。下划线区域代表FH结构域
Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Pffoxl2
Note: The bold and normal numbers on the left indicate the positions of the Pffoxl2 gene cDNA sequence and the amino acid residues respectively. The boxed letters of cDNA sequence are initiation codon and termination codon, respectively
不同分支，并和长牡蛎foxl2蛋白聚为一支（图3）。
2. 2 Pffoxl2基因在合浦珠母贝不同发育时期和成体不同组织中的表达分析
不同发育时期的实时荧光定量PCR分析显示，Pffoxl2在5个时期都有表达，表达量从高到底依次为附着期>眼点期>担轮期>壳顶期>D型期（图4）。其中附着期表达量和其它时期相比差异显著（P<0.05），且达到D型期4倍。精子和卵子中的表达分析显示，Pffoxl2基因在卵子中呈现极高的表达量，显著高于其它不同发育时期，且与精子呈现显著差异（图4）。不同组织的实时荧光定量PCR分析显示，Pffoxl2在9个组织都有表达，不同组织的表达水平呈现明显差异，在性腺中表达量最高，与其它7种组织差异显著，卵巢中的表达量显著高于精巢，其次是珍珠囊，也呈现高表达，显著高于
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Pinctada fucata 合浦珠母贝 MSEIDLRFKDVKLSENMNFRIENEETLTELRHRHFRSVMK--GIESGLNEP-LDSKIWKPSIIPSDFSSTCKYGSK--FGIAARLENNSGAKPKDDSNTQNPKLKNVKSETDIKTEHPSK 115
Mus musculus 小家鼠 --------------------------------------------------------------------MMASYPEPEDTAGTLLAPES-GRAVKEAEASPPSPGKGGG----TTPEKP-- 45
Homo sapiens 人 --------------------------------------------------------------------MMASYPEPEDAAGALLAPET-GRTVKEPEGPPPSPGKGGGGGGGTAPEKP-- 49
Danio rerio 斑马鱼 --------------------------------------------------------------------MMATYPGHEDNGMILMDTTS-SSAEKDRTKDEAPPEKG--------PDKS-- 41
Xenopus laevis 非洲爪蟾 ---------------------------------------------------------------------MASFQSPEPGPVALMSHNSNGNKESDRGKEELQQEKG--------QEKS-- 41
Crassostrea gigas 太平洋牡蛎 MSE--------NKNENVSNSVS-DENFYDFKMRLMRPSSK--FLESGFSESSFENKIWKHSFLSGEFSSNCKYGSKVSFGIAARLENPSNSKPAENKEEEFVETKKIKSE---KLEEKSK 106
Azumapecten farreri 栉孔扇贝 -----------MALSFYDSKMEEKADFMDIKFRLFRGGKRPEGFGDNIDNTCDATKTWKQHVGSGLSSPHYKYSSKVSYGVAARLQNN---QHCEDKLTETEDLKPVKNDTEVKEETPIM 106
Clustal Consensus .: : * : 4
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
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Pinctada fucata 合浦珠母贝 SSSKTCQESIKEEEDLRNSDPDQKPPYSYVALIAMAIKESGEKRLTLSGIYQYIINKFPYYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFVKVPREGGGERKGNFWTLDPAFEDMFEKGNYRRRRRMR 235
Mus musculus 小家鼠 -------------------DPAQKPPYSYVALIAMAIRESAEKRLTLSGIYQYIIAKFPFYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFIKVPREGGGERKGNYWTLDPACEDMFEKGNYRRRRRMK 146
Homo sapiens 人 -------------------DPAQKPPYSYVALIAMAIRESAEKRLTLSGIYQYIIAKFPFYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFIKVPREGGGERKGNYWTLDPACEDMFEKGNYRRRRRMK 150
Danio rerio 斑马鱼 -------------------DPTQKPPYSYVALIAMAIRESSEKRLTLSGIYQYIISKFPFYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFIKVPREGGGERKGNYWTLDPACEDMFEKGNYRRRRRMK 142
Xenopus laevis 非洲爪蟾 -------------------DPSQKPPYSYVALIAMAIRESQEKRLTLSAIYQYIISKFPFYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFIKVPREGGGERKGNYWTLDPACEDMFEKGNYRRRRRMK 142
Crassostrea gigas 太平洋牡蛎 SSAG----NVKIENENKYTDPEQKPPFSYVALIAMAIKESSEKRLTLSGIYQFIINKFPYYEKNKKGWQNSIRHNLSLNECFVKVPREGGEERKGNFWTLDPAFEDMFEKGNYRRRRRMR 222
Azumapecten farreri 栉孔扇贝 PIQRDSKCRKFEEDSNKYSDPDQKPPFSYVALIAMAIKESGDKRLTLSGIYQYIISKFPYYERNKKGWQNSIRHNLSLNECFVKVPREGGGERKGNFWTLDPAFNDMFEKGNYRRRRRMR 226
Clustal Consensus ** ****:**********:** :******.***:** ***:**:*******************:******* *****:****** :**************: 99
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
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Pinctada fucata 合浦珠母贝 RPYR---AALSLPKPLFA--------------DGNYGSYNQFS-LTKSYFS---PPPAYSQYSQYSPWAQAFAQTSPHN--------------------------VASAMNQIGGYA--S 306
Mus musculus 小家鼠 RPFRPPPAHFQPGKGLFGSGGAAGGCGVPGAGADGYGYLAPPKYLQSGFLNNSWPLPQPPSPMPYASCQMAAAAAAAAAAAAAA-----------GPGSPGAAAVVKGLAGPAASYGPYS 255
Homo sapiens 人 RPFRPPPAHFQPGKGLFGAGGAAGGCGVAGAGADGYGYLAPPKYLQSGFLNNSWPLPQPPSPMPYASCQMAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGPGSPGAAAVVKGLAGPAASYGPYT 270
Danio rerio 斑马鱼 RPFRPPPTHFQPGKSLFG--------------GEGYGYLSPPKYLQSGFINNSWS----PAPMSYTSCQVSSGSVSPVN--------------------------MKGLSAP-SSYNPYS 217
Xenopus laevis 非洲爪蟾 RPFRPPPTHFQAGKSLFG--------------SDTYGYLSPPKYLQSTFMNNSWPLSQPPAPVSYTSCQMAGGNVSPVN--------------------------VKGLSAS-SSYSPYS 221
Crassostrea gigas 太平洋牡蛎 RPYR---ASLSLPKPLFAP-------------DSHCGPYNQFS-LSKPYFS---PPP-YSQYSQYQGWAQALAHNSSQAG-------------------------MASAMNQIGNYS--S 294
Azumapecten farreri 栉孔扇贝 RPYR---AAISLPKPLFA--------------DNHCGPYNQFAQLTKPYFS---PPP-YSQYSQYSPWALTHNASAHQG----------------------------MGMSQISNFN--S 295
Clustal Consensus **:* : :. * **. * * . ::. . . * : : ..: : 117
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
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Pinctada fucata 合浦珠母贝 CTQARVP-----ASQCGYNA---------------AVQSAMQMSPSPGP------------------TYPQLNDYGSLPPPPHGASFPF-PYRQQSEPLNHMHYTYWTER---------- 377
Mus musculus 小家鼠 RVQSMALPPGVVNSYNGLGGPPAAPPPPPPPPHPHPHPHAHHLHAAAAPPPAPPHHGAAAPPPGQLSPASPATAAPPAPAPTSAPGLQFACARQP--ELAMMHCSYWDHDSKTGALHSRL 373
Homo sapiens 人 RVQSMALPPGVVNSYNGLGGPPAAPPPP---PHPHPHPHAHHLHAAAAPPPAPPHHGAAAPPPGQLSPASPATAAPPAPAPTSAPGLQFACARQP--ELAMMHCSYWDHDSKTGALHSRL 385
Danio rerio 斑马鱼 RVQSIGLPS-MVNSYNGIS----------------HHHHHHHTHPHALP---------------HAQQLSPATAAAPPVTTGNGTGLQFACSRQPA-ELSMMHCSYWDHESKHSALHARI 304
Xenopus laevis 非洲爪蟾 RVQSMSLPS-MVNSYNGMS--------------HHHHPHAHHSHHSHHA-----------------QQLSPASPPPAPPAPPN--GVQFTCARQPP-ELSMMHCSYWDHDAKHSALHARI 306
Crassostrea gigas 太平洋牡蛎 CTQGRVPPPGASITQCGYN----------------AMQQAMQISPPHAP------------------SYTQLNDYPAVPTP--GTGFPF-AYRQQGDTLNHMHYSYWTDR---------- 367
Azumapecten farreri 栉孔扇贝 CTQARVPPPGSTISSCGYN----------------PLPSGVQLSPSAGT------------------TYSQLNDYNAVNPS---GPFPFGPYRQQGDSLNAVHYTYWGER---------- 368
Clustal Consensus .*. : * . : . . . . .. . * ** * :* :** . 130
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Pinctada fucata 合浦珠母贝 -- 377
Mus musculus 小家鼠 DL 375
Homo sapiens 人 DL 387
Danio rerio 斑马鱼 DI 306
Xenopus laevis 非洲爪蟾 DL 308
Crassostrea gigas 太平洋牡蛎 -- 367
Azumapecten farreri 栉孔扇贝 -- 368
Clustal Consensus 130
图2 不同物种的foxl2蛋白成熟区的多序列比对
Fig. 2 Multiple comparisons of mature foxl2 from different species
注：图中“*”标记完全一致的氨基酸残基
Note: The identical amino acid residues are marked with the (*)
图3 基于NJ法构建Pffoxl2氨基酸序列的系统发育树(合浦珠母贝用黑色粗体表示)
Fig. 3 Neighbour-Joining phylogenetic tree base on Pffoxl2（P. fucata is marked by bold black font）
图4 Pffoxl2在合浦贝精、卵细胞及不同发育时期的相对表达量
注：不同小写字母代表不同组织中基因相对表达量差异显著（n=3, P<0.05）
Fig. 4 The relative expression level of Pffoxl2 in sperms and eggs and different tissues of P. fucata
Note: The significant difference is indicated by different letters (n=3, P< 0.05)
其它6种组织（P<0.05）（图5）。
2.3 性腺损伤修复过程中Pffoxl2的表达分析
实时荧光定量PCR反应显示，性腺损伤瞬间与对照组没有显著差异，在2 h时出现显著下调，而在4 h和6 h出现显著上升，尤其是6 h时达到最高，为对照组的6倍左右。随后表达量开始明显下降到与对照组同一水平，随后再次小幅显著上升（P<0.05）（图6）。
2.4 贝壳缺刻处理后Pffoxl2的表达分析
缺刻处理后观察缺口变化，处理48 h后缺口部位可观察到半透明的新生薄层。实时荧光定量PCR<
