辛伐他汀对去卵巢大鼠骨改建的治疗作用

夏雯  付小明 谢福平 陈江

【摘要】 目的: 探讨辛伐他汀药物治疗对骨质疏松大鼠骨改建的影响。方法：将30只3月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组（SHAM组）、卵巢切除组（OVX组）和卵巢切除加辛伐他汀治疗组（OVX+SIM组）。建模后12周，实验组给予辛伐他汀5mg . kg ^-1.d^-1；其余两组用等量生理盐水灌服。在给药后第8周取血清观察各组大鼠的骨代谢情况。结果：与OVX组相比，给药后8周时OVX+SIM组血清OCN、BALP以及Ca、P浓度明显上升，比较有统计学意义(P<0.05)；且OCN、BALP以及Ca、P的浓度接近与SHAM组。结论：血清生化指标结果表明辛伐他汀药物治疗对骨质疏松大鼠有一定的促成骨作用。

【关键词】骨质疏松症；辛伐他汀；骨改建

Effect  of  simvastatin on bone remodeling in osteoporotic rats

【ABSTRACT】 Objective: To investigate the effect of Simvastatin therapy on bone remodeling in ovariectomized rats. Methods: 30 female Sprague-Dawley Rats aged about 3 months were randomly divided into three groups: Sham-operated group (SHAM), ovariectomized group (OVX) and Simvastatin with ovariectomized rats group (OVX+SIM). Simvastatin [5mg•kg^-1•d^-1] started in OVX+SIM group and normal saline were given to the other two groups accordingly after 12 weeks. The treatment lasted 8 weeks then the serum was taken to analyze the biochemical markers of rats . Results: The level of OCN、BALP and Ca、P were significantly increased in the OVX+SIM group compared with OVX group at administration 8weeks (P< 0.05). Conclusions: The results support a general beneficial effect of Simvastatin on bone remodeling in osteoporotic rats

【Key words】   Osteoporosis; Simvastatin; Bone metabolism;

骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是以骨量减少和骨微结构破坏而导致骨脆性增加及易骨折为特征的全身性骨代谢疾病^[1]。是目前影响老年人健康和生活质量的常见疾病之一。随着人口老龄化的增加，骨质疏松症的发病率也同样增加^[2]，全球有约2亿骨质疏松症患者，我国该疾病的现有患者超过9000万，占总人口的7.1 %^[3] 。寻找一种能够改善全身以及局部骨质疏松症的药物已成为越来越多该疾病相关领域临床医生所关注的热点。研究者近年发现，由于骨质疏松症的特点是骨吸收增加和骨形成不足，而他汀类药物具有一定的促进骨形成的作用^[4]。但是他汀类药物能否改善患者全身的骨质疏松状态尚未见研究报道^[5]。本实验从建立大鼠绝经后骨质疏松动物模型出发，在建模成功的基础上給予辛伐他汀药物治疗，通过各项血清生化指标检测，观察辛伐他汀对骨质疏松症大鼠骨改建的影响，为研究辛伐他汀对骨质疏松症大鼠中种植体骨结合的影响奠定基础，也为临床上骨质疏松症的缺牙患者选用种植治疗提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物：

3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，体重250～270g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。适应性喂养2w后进行实验。

1.2 主要仪器和试剂：

全自动生化分析仪（HITACHI，日本）；全自动酶标仪（ Huma，德国）；辛伐他汀片（Simvastatin, 杭州默沙东制药有限公司）；钙、无机磷测定试剂盒（北京中生北控生物科技有限公司）；大鼠血清骨源性碱性磷酸酶(BALP)（美国ADL公司）；大鼠血清骨钙素(OCN)（美国ADL公司）。

1.3 实验分组和建模方法

依据体重随机区组设计分组：（每组10只，平均体重统计组件分析无统计学差异。）

假手术组(sham-ovariectomized rats, SHAM)：暴露双侧卵巢并在卵巢附近切取与卵巢大小相近的脂肪组织一块，术后12周开始每天给予生理盐水灌服。

卵巢切除组(ovariectomized rats, OVX)：切除双侧卵巢，术后第12周开始每天给予生理盐水灌服。

卵巢切除加辛伐他汀组（ovariectomized rats ＋simvastatin， OVX + SIM）：切除双侧卵巢，术后第12周开始每天给予辛伐他汀5mg . kg ^-1.d^-1灌服。

1.4 辛伐他汀给药：

药物配制：根据人与动物体重等效剂量比例公式计算出大鼠用药剂量为5mg . kg ^-1.d^-1 ，辛伐他汀片碾碎后用生理盐水配制成1mg/ml的的混悬液。于4℃条件下避光、防潮保存。

给药方法：卵巢切除术后12周，实验组以辛伐他汀5mg . kg ^-1.d^-1 灌服，用药前摇匀,每天定时给药，每次给药进入深度有刻度控制。大鼠灌胃后观察，确保大鼠没有吐出药物。给药频率为1次/天，连续8周；对照组给予同等体积生理盐水灌服。

1.5 大鼠骨质疏松模型鉴定：

实验过程中观察大鼠的生活习性变化，12周后对卵巢切术组大鼠进行组织学观察及骨密度检测，确定骨质疏松症大鼠建模成功。

1.6 血清生化检测：

血清标本获取：大鼠给药后第8周用乙醚麻醉，眶后静脉取血，常温静置2h分层，离心分离血清，测量血清OCN、BALP和Ca、P的表达。

1.7． 统计学分析： 

采用SPSS19.0统计软件对测量结果进行分析，对实验数据进行正态性检验，正态性分布实验数据以均数±标准差表示，多标本均数间的比较采用随机区组方法分析，样本均数间的两两比较用q检验，同一检验指标前后比较采用配对t检验，P< 0.05差别有统计学意义。

2、结果

2.1 大鼠灌药后一般情况观察

所有大鼠卵巢切除术后切口愈合良好，经辛伐他汀治疗后饮食、活动正常，实验阶段无死亡。

2.2 大鼠卵巢切除术后12周骨密度检测

OVX组大鼠与SHAM组相比，头部骨密度显著降低(P< 0.01)，全身、脊椎骨密度明显降低(P< 0.05)，具有统计学意义。（见表1） 

表1 大鼠术后全身、头部及脊椎的BMD变化（g/cm2, n=8, ±s）

注：与SHAM组比较 * P<0.05 ， ** P<0.01

2.3 大鼠卵巢切除术后12周组织学观察结果

大鼠胫骨骨组织病理学检查显示：卵巢切除术后12周，光学显微镜观察OVX组骨小梁较为稀疏、变细、数量明显减少并失去正常的网状结构，皮质骨变薄，部分区域骨小梁出现空洞，骨髓腔面积增大； SHAM组骨小梁结构正常，排列整齐， 数目较多，较粗，并致密地交织成网状结构，皮质骨致密（图1-1，图1-2）。  

图1-1  OVX组（HE染色10×2）               图1-2 SHAM组（HE染色10×2）

2.4  血清生化指标测定结果：

辛伐他汀给药第8周

OVX，OVX+SIM组与SHAM组血清Ca、P浓度比较有统计学意义(P< 0.05)， OVX组与OVX+SIM组间血清Ca、P及ALP的浓度比较均无显著性差异。

SHAM，OVX+SIM组与OVX组血清OCN、BALP浓度比较有统计学意义(P< 0.05)，SHAM组与OVX+SIM组间血清OCN、BALP的浓度比较均无显著性差异。

表2  血清P、Ca、OCN、BALP测量结果（`x±s，n=10）

备注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05 

3、讨论

正常的骨代谢主要依靠破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间的协调平衡，骨转换的过程即是破骨细胞不断清除旧骨，成骨细胞形成类骨质并进行矿化的过程。骨量的多少取决于同一骨重建单位中骨形成与骨吸收的平衡。当这一平衡被破坏，骨吸收大于骨形成时，就导致了骨质疏松症的发生。绝经后骨质疏松症的主要特征是由于雌激素减少，早期骨吸收与骨形成均加速，表现为高转换骨代谢，由于骨吸收的过程较骨形成的过程长，而造成骨量丢失。后期骨转换的特点为成骨细胞功能低下，以骨形成降低为主^[6]。骨愈合是一个复杂的过程，依赖于一系列相关的细胞内和细胞外反应^[7]，而骨转换过程可以通过血清生化指标反映出来，间接显示成骨细胞与破骨细胞的活性。本实验在成功建立骨质疏松症大鼠模型的基础上，辛伐他汀干预治疗一段时间后，通过检测血清Ca、P以及BALP、OCN等骨代谢标志物的代谢情况，观察辛伐他汀对大鼠骨改建的影响。 

骨特异性碱性磷酸酶（Bone Alkaline Phosphatase B-ALP）是特异性骨形成标志物，是成骨细胞的一种胞外酶，它在细胞内合成，主要作用是分解有机磷酸化合物，使产生的无机磷离子与钙离子结合形成羟磷灰石后沉积在骨组织，其含量变化能够直接反映成骨细胞活性。比总磷酸酶更能反映骨的合成状况^[8]。本实验显示用药后8周，SHAM，SIM组血清B-ALP浓度明显高于OVX组，比较有统计学意义(P< 0.05)，说明被切除卵巢的大鼠骨吸收逐渐占据优势,从而在血清学检测上出现了BALP逐渐下降的趋势。SIM组BALP浓度变化与SHAM相一致，两者比较无明显差别，说明辛伐他汀能够促进成骨细胞的增殖和分化、增加基质的沉积与矿化的作用，能改变成骨细胞分化标志物BALP 的表达，使骨质疏松症高转换性骨代谢状态得到改善。揭示辛伐他汀在一定程度上可促进骨形成，抑制骨吸收，使机体骨代谢处于骨形成大于骨吸收的正平衡状态，对预防骨质的快速丢失，改善骨质量，具有重要意义。

骨钙素（osteocalin, OCN）主要作用是促进骨组织的正常矿化过程，抑制异常羟磷灰石的形成、抑制软骨矿化速率。由成骨细胞产生，产生后大部分沉积在骨基质中，小部分分泌进入血循环^[9]。本实验中OVX组OCN的含量明显低于SHAM，SIM组(P< 0.05)，而经辛伐他汀药物治疗后，用药8周后SIM组大鼠血清OCN含量与SHAM组无明显差别，提示辛伐他汀能刺激成骨细胞活性，使骨形成活动增强。

本实验通过检测血清Ca、P以及BALP、OCN等指标，结果显示辛伐他汀能够改善血清骨代谢生化指标，可以减少骨吸收，抑制去卵巢大鼠高骨转换率，对绝经后骨质疏松症具有一定的防治作用，具有广阔的应用前景。

参考文献

[1] Liu Z, Piao J, Pang L, et al. The diagnostic criteria for primary osteoporosis and the incidence of osteoporosis in China[J]. J Bone Miner Metab, 2002, 20(4): 181-189.

  [2] NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis Prevention, Diagnosis, and Therapy. Osteoporosis prevention, diagnosis, and therapy[J]. JAMA, 2001, 285(6): 785-795.

[3] 曹惠英，杨锦华. 骨质疏松症的评价方法述评[J]. 亚太传统医药.2007;5:32-34.

[4]  Bellosta S，Ferri N，Bernini F，et al． Non-lipid related effects of statins ［J］ Ann Med，2000; 32:164-176.

[5]  Mundy G,Garrett R,Harris S,et al . Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science,1999,286(5446):1946-1949.

[6]  L.A. Fitzpatrick. Estrogen therapy for postmenopausal osteoporosis. Arq Bras Endocrinol Metabolic. 2006; 50 (4):705-719.

[7]  Takeda Y, et al．Int J Oral Maxillofac Implants, 2015,30(5);1187-1196

  [8]  Tikiz C, Taneli F, et al. Effects of simvastatin on bone mineral density and remodeling parameters in postmenopausal osteopenic subjects: 1-year follow-up study [J]. Clin Rheumatol.2005; 24(5):447-452.

  [9]  Du Z, Chen J, Xiao Y.Effects of Simvastatin on bone healing around titanium implants in osteoporotic rats [J]. Clin oral implants Res.2009; 20(2):145-150. [40]Hunziker J, Wronski TJ, Miller SC. Mandibular bone formation rates in aged ovariectomized rats treated with anti-restorative agents alone and in combination with intermittent parathyroid hormone. J Dent Res.2007;79(6):1431–1438.