布鲁氏菌S2308及S2308ΔVceA缺失株的生长特征分析

王小凤，史静雪，李明奇，郭  嘉，赵天艺，刘  航，张  樊，张辉

（石河子大学动物科技学院/动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003）

文章已被生物技术杂志社录用，生物技术杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/shengwujishu

摘  要：为了培养布鲁氏菌S2308基因缺失突变株ΔVceA，并分析其生长特征和在HPT-8细胞中的存活能力。试验采用测定缺失株ΔVceA在培养过程中的OD值并做生长曲线；用缺失株和亲本株侵染HPT-8细胞后检测细胞上清液细胞因子TNF-α和IL-1β的释放并进行胞内CFU计数的方法对基因缺失突变株ΔVceA进行了研究。结果表明：缺失株和亲本株测得的生长曲线均在12h达到对数生长期，30h进入平台期；胞内CFU计数实验中VceA缺失株在侵染细胞12h和感染小鼠14d时显著低于亲本株；在侵染12h时TNF-α和IL-1β的分泌量缺失株显著低于亲本株（P<0.05）。说明：基因缺失突变株ΔVceA生长曲线显示生长趋势良好，和亲本株没有显著性差异，缺失株侵染细胞后TNF-α和IL-1β的分泌显著减少，且缺失株在胞内的存活能力变弱。

关键词：布鲁氏菌；VceA；生长曲线；胞内存活；HPT-8细胞；CFU计数

Analysis of growth characteristics of Brucella S2308 and S2308 ΔVceA deletion strains

WANG Xiao-feng, SHI Jing-xue, LI Ming-qi, GUO Jia, ZHAO Tian-yi, LIU Hang, ZHANG Fan, ZHANG Hui^*,

(Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease/College of Animal Science & Technology, Shihezi University,Shihezi, Xinjiang 832003, China)

Abstract: The mutant was cultured and its growth characteristics and viability in HPT-8 cells were analyzed. The OD value and growth curve of the deletion strain in the culture process were measured, and the release of the cytokines TNF- α and IL-1 β in the supernatant and the intracellular CFU count were detected after infecting the HPT-8 cells by the deletion strain and the parent strain. The growth curve of deletion strain and parent strain reached the logarithmic growth stage at 12 h and entered the plateau stage at 30 h, and the VceA deletion strain was significantly lower than parent strain at 12 h after infection and 14 d after infection. The exudation of TNF- α and IL-1 β at 12 h was significantly lower than that of parent strain (P < 0. 05). The growth curve of the deletion strain showed that the growth trend was good, and there was no significant difference between the deletion strain and the parent strain. The secretion of TNF- α and IL-1 β was significantly decreased after the deletion strain was infected with the cell, and the viability of the missing strain in the cell became weaker. This laid a foundation for the study of the T4SS function of S2308.

Keywords:Brucella;VceA; growth curve; Intracellular survival; HPT-8 cell; CFU count

布鲁氏菌病是牛、羊、猪等动物和人共患的一种传染病，被我国列为二类动物疫病。近年来，该病在全球范围呈不断上升的趋势^[1]，各国政府和研究部门都提高了对此病的关注，能否找到预防或治愈布鲁氏菌病的方法成为至关重要大事。

布鲁氏菌是革兰氏阴性致病菌^[2]，它的形状通常为球杆或短杆状，无鞭毛，不形成荚膜和芽孢，也不产生外毒素。不能进行独自生存和共生生存，在感染宿主细胞时，巨噬细胞和胚胎滋养层细胞是它优先选择的对象，并在侵入的细胞中生存和复制^[3]。主要的毒力因子有脂多糖、T4SS^[4]、外膜蛋白和 Bvr R/Bvr S双组分系统，以及密度感应系统等^[5]。布鲁氏菌T4SS在躲避宿主免疫监视和造成慢性感染中起着举足轻重的作用，T4SS分泌的效应因子能干扰宿主细胞的功能，这些效应子很复杂，与蛋白质类或核蛋白复合体相似。宿主被病原微生物感染后，通常可以产生 IL-18 和 IL-1β 等促炎因子并引起炎症发生，促炎性因子 IL-1β 的释放在机体炎症引起的发热机制中有着举足轻重的作用，并且也是机体抵御病原体入侵，使其免受组织损伤的因子，两炎性因子都能诱导机体二级细胞因子的产生^[6]。由于 IL-1β 和TNF-α 等促炎因子在机体抵抗病原微生物感染中具有重要作用^[7]。为了更好的了解 T4SS 效应蛋白的作用，本研究中培养ΔVceA基因缺失突变株，分析生长特点和在细胞中的存活能力，探讨布鲁氏菌分泌蛋白 VceA缺失株侵染后对TNF-α和IL-1β的分泌水平，旨在更深入研究 T4SS 分泌蛋白的功能和调控奠定基础。

1 材料

1.1 菌株

流产布鲁氏菌 2308（S2308）由新疆石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存，布鲁氏菌 ΔVceA 也由本实验室构建。

1.2 试验动物

    Balb/C小鼠27只

1.3 试剂

布鲁氏菌固体培养基（Brucella Agar）和液体培养基（Brucella Broth）均购自BD公司；氨苄青霉素和卡那青霉素均购自 Sigma 公司，ELISA试剂盒，其他为国产分析纯化。

1.4 主要仪器

超速离心机( eppendorf，centrifuge-5415D），恒温培养箱(DNP-9162)，超净工作台，微量紫外分光光度计(Nanodrop-2000)，酶标仪，摇床，匀浆机。

2方法

2.1牛种布鲁氏菌 ΔVceA生长特性检测

分别挑取 S2308 ，ΔVceA 单克隆菌落置于布鲁氏菌液体培养基中200 r/min 37 ℃培养到OD_600nm=0.8时，用新鲜的布鲁氏菌液体培养基将各实验组中菌液调整到 OD_600nm=0.1时继续摇床培养，培养每间隔2小时后收取菌液灭活后检测 OD_600nm的值，直到各菌株培养到平台期为止，并根据时间和OD值绘制布鲁氏菌的生长曲线图。

2.2  HPT-8 细胞的侵染及 CFU 计数

2.2.1细菌侵染细胞和感染小鼠模型的建立

用六孔板做细胞侵染实验当细胞贴壁后将每孔更换新鲜的培养液，按照侵染复数 MOI=100:1 加入比浊后的布鲁氏菌到细胞上清中，缓缓轻摇混匀置于37 ℃、5% CO₂ 的培养箱中孵育1h，每孔加入2.5 μL/mL硫酸庆大霉素作用45 min 弃去细胞上清培养液并且用PBS清洗3次再添加新鲜的细胞培养液，放入37 ℃、 5% CO₂ 细胞培养箱培养。

按照以上步骤培养布鲁氏菌S2308及其缺失株并进行计数，每只小鼠腹腔注射 200 μL CFU为5×10⁶ /mL的两种菌株，每组9只小母鼠，对照组的小母鼠腹腔注射等量的PBS缓冲液。

2.2.2布鲁氏菌ΔVceA在HPT-8细胞中的存活及在小鼠脾脏的CFU计数

将长势良好的 HPT-8 传到六孔细胞板中，每个孔的细胞数约为10⁶ 个，当细胞贴壁后加入生长到对数生长期的S2308，ΔVceA菌量为10⁸，侵染3 h、12 h 和24 h时用0.1%曲拉通裂解细胞，做梯度稀释涂布布鲁氏菌固体培养基，37 ℃倒置生长 3-5天，CFU计数。

小鼠感染模型建立好后，分别在注射后1 d、7 d、14 d、28 d、56 d，小鼠颈静脉脱臼致死后无菌条件下剖开腹腔，取出脾脏，剪碎放入无菌的EP管中并加入1 mL的PBS，在匀浆机上匀浆30 min后，用PBS对其进行梯度稀释，前3个时间点用10³ 和10⁴ 的稀释度涂布布鲁氏菌固体培养基，后两个时间点选用10² 和10³ 稀释度涂布，37 ℃恒温箱中倒置培养3天后计算生长的菌落数。

2.3侵染HPT-8细胞后细胞因子的检测

用 S2308，ΔVceA分别侵染 HPT-8 细胞3 h，12 h和24 h后分别收取细胞培养上清液，用TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒检测其释放量。绘制标准曲线：运用 Excel 软件绘制以吸光值为横坐标，标准品浓度为纵坐标的标准曲线如图 1，按照得出的方程计算各样品的浓度值。

图1  炎性细胞因子标准曲线

A：TNF-α标准曲线；B：IL-1β 标准曲线；

Fig.1  The standard curve of Inflammatory cytokines

A: TNF-α standard curve. B: IL-1β standard curve.

3 结果与分析

3.1布鲁氏菌 S2308ΔvceA 及其亲本株 S2308 生长曲线

通过对布鲁氏菌 S2308ΔvceA 及其亲本株 S2308的生长曲线的绘制可以看出，布鲁氏菌 S2308ΔvceA及其亲本株 S2308 生长趋势基本一致，培养至 12h 时所有菌株都已到达对数生长期，到 30h 到达细菌生长平台期（图2）。这表明vceA 基因的缺失并不影响细菌的生长繁殖。

图2 牛种布鲁氏菌S2308ΔvceA与其亲本株S2308的生长曲线

Fig.2 The gowth curve of B.abortus 2308 ΔvceA strains and B.abortus 2308 strain

3.2牛布鲁氏菌ΔVceA侵染HPT-8细胞和感染小鼠后的CFU计数

用布鲁氏菌ΔVceA及其亲本株S2308以100:1的侵染复数（MOI）侵染 HPT-8 细胞，在侵染后0 h，3 h，12 h，24 h 用曲拉通裂解细胞收样，并且梯度稀释到10² 和10³ 分别涂布布鲁氏菌固体培养基，培养约3-5天后数菌落数。计算Log值绘制折线图，如图2A，布鲁氏菌ΔVceA在侵染12 h时显著低于亲本株，但是开始有上升的趋势，到24h时和亲本株没有显著性差异。

用两菌株分别给小鼠腹腔注射后，在感染1 d，7 d，14 d，28 d 和56 d时无菌取出小鼠脾脏，匀浆后进行梯度稀释，涂布布鲁氏菌固体培养基，倒置37 ℃培养 3-5 天计数。结果如图2B，ΔVceA在感染14 d时显著低于亲本株（P<0.01），之后有上升的趋势在28 d时和亲本株无差异。

图3 牛布鲁氏菌ΔVceA和S2308在HPT-8细胞中的存活能力和在小鼠脾脏中的载菌量

A：HPT-8 细胞CFU计数；B：小鼠脾脏CFU计数；

Fig.3 The survival ability of B.abortus ΔVceA, ΔVceC strains and B.abortus 2308 strain in cell HPT-8 and mouse spleen

A:CFU counts in HPT-8 cells. B: CFU counts in mouse spleen.

3.3  VceA缺失株对HPT-8细胞细胞因子分泌的影响

HPT-8被侵染3h，12h和24h后收取上清，根据TNF-α和IL-1β试剂盒操作，用酶标仪在OD₄₅₀nm处测定吸光值，然后带入标准曲线计算TNF-α和IL-1β 的浓度。结果如图4所示，3h，12h和24h时三个侵染组TNF-α和IL-1β的分泌量均高于PBS对照组，在侵染12 h时TNF-α（P<0.05）和IL-1β（P<0.01）的分泌量两缺失株组均显著低于亲本株。

图4 细胞因子表达量柱状图

A：细胞因子TNF-α的表达量；B：细胞因子IL-1β的表达量；

Fig.4 The histograms of expressions of cytokines

A: The expression of cytokine TNF-α. B:The expression of cytokine IL-1β.

4.讨论

布鲁氏菌是一种典型的胞内致病菌，研究布鲁氏菌T4SS的作用机制和其效应蛋白有助于阐明胞内菌的致病机理^[8]，T4SS是布鲁氏菌的一种关键毒力因子，其所分泌的效应蛋白帮助调节布鲁氏菌在胞内的生存以及感染时的免疫应答^[9]，有研究表明T4SS 的效应蛋白VceA是一种由105个氨基酸组成的蛋白质，在所有已测序的布鲁氏菌基因组中都是保守的，VceA编码的蛋白是T4SS的蛋白新底物^[10-12]。

本研究根据流产布鲁氏菌ΔVceA菌株的生长曲线看出突变株和亲本株在生长趋势上并没有显著区别，基本趋于一致。这表明 VceA基因的缺失并不影响细菌的生长繁殖。但它们在HPT-8细胞中的存活能力 VceA缺失株在胞内的存活率比其亲本株弱；滋养层细胞有特殊免疫学特性，可以运用指定途径，在母畜和胎儿间出现一种特别的免疫隔离带，这种结构在调节母体免疫排斥胎儿中发挥着重要的作用^[13]，而布鲁氏菌感染常导致母畜流产可能的原因就是破坏了此结构。从本研究结果中可以看出，ΔVceA的胞内存活率要比野毒株弱，这可能与布鲁氏菌VceA蛋白的功能密切相关，也给布鲁氏菌致病机制的深入研究积累了一定的理论基础。

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