脑心通胶囊通过PI3K/AKT/eNOS信号通路促进血管新生加速Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合

宋  敏¹，陈  璐¹，张丽媛¹，李春晓¹，房志锐¹，张璐莎¹，Joel Wake¹，王  虹^{2 *}

(1. 方剂学教育部重点实验室，天津市中药药理学重点实验室，天津中医药大学中医药研究院，天津 300193；2.天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193）

[摘要] 目的：研究脑心通胶囊（NaoXinTong, NXT）对Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的作用和作用机制。方法: 将8-12周的db/+小鼠和db/db小鼠适应性喂养一周后，按体重随机分组为db/+模型组、db/db模型组、db/db 脑心通（0.7 g/kg）组，建立切除伤口夹板模型，每天灌胃给药并记录小鼠体重，每两天监测血糖并对伤口拍照测量伤口面积，分别在术后3、7、16天取小鼠肝、肾、伤口处皮肤组织，取血并分离血清。取血清和肝肾组织研磨液上清用TG、TC、LDL-C、HDL-C、Scr、ALT、BUN试剂盒测定相关的生化指标，小鼠伤口处皮肤组织进行切片或立即冷冻保存。免疫荧光检测伤口周围毛细血管的密度，新鲜组织用来提取蛋白并用Western Blotting检测VEGF、PI3K/P-PI3K、AKT/P-AKT、eNOS/P-eNOS在伤口边缘的表达。结果:与db/db模型组相比，db/db 脑心通组小鼠伤口愈合率增加，伤口周围的血管密度和VEGF的表达增加，PI3K/AKT/eNOS的磷酸化增加，但糖尿病小鼠的体重、血糖和糖脂代谢的生化指标没有变化。结论：脑心通胶囊通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路增加VEGF表达促进血管新生加速Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合。

关键词：NXT；血管新生；伤口愈合；DFU；PI3K/AKT/eNOS信号通路

Naoxintong capsule accelerates wound healing and promotes angiogenesis in type 2 diabetic mice through PI3K/AKT/eNOS signaling pathway  SONG Xin¹, CHEN Lu¹, ZHANG Li-yuan¹,  LI Chun-xiao¹, ZHANG lu-sha¹, FANG Zhirui¹, Joel wake coffie¹, WANG Hong^* (1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Institute of Chinese Medicine，Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology，Tianjin 300193，China;)

 [Abstract]  Objective: To study the effect and mechanism of Naoxintong capsule (NXT) on wound healing in type 2 diabetic mice. Methods: 8-12 weeks db/+ mice and db/db mice were randomly divided into db/+ model group, db/ db model group and db/db Naoxintong（0.7 g/kg）. The splint model of excision wound was established. Oral administration and body weight was recorded every day. The fasting blood glucose was monitored and the wound area was measured by photography every two days. At 3, 7 and 16 days after procedure, the skin tissues , liver, kidney  were obtained, blood was collected and serum was separated. The supernatants of serum, liver and kidney tissues were taken and the biochemical indexes were determined by TG, TC, LDL-C, HDL-C, Scr, ALT and BUN kits. The skin tissues at the wounds of mice were sliced or cryopreserved immediately. Immunofluorescence was employed to detect the density of capillaries around the wound, and Western Blotting was used to measure the expression of VEGF, PI3K/P-PI3K, AKT/P-AKT and eNOS/P-eNOS at the edge of the wound. Results: Compared with the db/db model group, the wound healing rate, the expression of vascular density and vascular endothelial growth factor increased notably, and the phosphorylation of PI3K / AKT / eNOS increased in db/db NXT group, but the biochemical indexes of body weight, fasting blood  glucose and lipid metabolism hadn’t change in process of wound closure. Conclusion: Naoxintong capsule can significantly accelerate wound healing and promote angiogenesis in type 2 diabetic mice by activate PI3K / AKT / eNOS signaling pathway.

[Key words]  NXT; angiogenesis; wound healing; DFU; PI3K/AKT/eNOS signaling pathway

糖尿病足溃疡（Diabetes Foots Ulcer, DFU）是糖尿病的并发症之一，在世界范围内发病率很高，近年来，世界上有近三分之一的人口患有糖尿病，其中650万人患有慢性皮肤溃疡^[1]。DFU的发病机制复杂，其中由糖尿病引起的缓慢的伤口愈合是糖尿病坏疽的主要原因，而高糖诱导的动脉粥样硬化加速，外周动脉闭塞是导致糖尿病病人伤口愈合迟缓的原因之一^[2]。在过去的几十年中，在预防DFU患者的发病率和治疗方面几乎没有取得突破，慢性创面的最佳治疗仅能达到很低的愈合率，而且通常具有暂时性的效果，此外，目前用于DFU的治疗药物大多是生长因子，这使得治疗成本增加。因此，对于DFU的预防和治疗，迫切需要更有效、更特异的药物^[3]。

脑心通胶囊（NaoXinTong, NXT）是含有11种中草药[黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝]，2种树脂药[乳香、没药]和3种动物药[全蝎、地龙、水蛭]的精粉混合物^[4]。在临床上NXT被作为益气活血，化瘀通络的中药复方，而且其心血管保护作用已在体内和体外研究中得到证实。现代药理学的研究表明，NXT能通过抑制小鼠树突状细胞的成熟、巨噬细胞iNO和NO的生成来减少动脉粥样硬化^[5-8]。而且脑心通能改善糖尿病小鼠的糖/脂代谢、维持组织结构完整性、降低糖尿病引起的肾功能障碍来抑制糖尿病肾病^[9]。我们的研究结果显示NXT能促进内皮祖细胞的动员与归巢，改善内皮细胞的功能和血管舒张和收缩功能，恢复缺血区血流灌注^[10]。由于高糖诱导的动脉粥样硬化，外周动脉闭塞是导致糖尿病创面愈合迟缓的原因之一，同时基于NXT对心血管系统的保护和糖尿病并发症的抑制作用，本研究旨在探讨NXT对典型的Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合的作用。

1. 材料

1.1  动物  8-12 周SPF级雄性C57BL/6JNju(db/+)和BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/JNju(db/db)小鼠由南京大学南京生物医学研究所提供。小鼠体内实验方案由天津中医药大学伦理委员会批准。小鼠在中国医学科学院放射医学动物研究所（天津）于温度22-25℃和相对湿度50%-60%条件下饲养。

1.2  药物  脑心通超微粉末(陕西步长制药有限公司)，由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、制乳香、制没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、全蝎、水蛭组成。将脑心通超微粉末加入生理盐水中配制成0.07 g/mL溶液，分装备用。

1.3 试剂  avertin (美国 Sigma 公司)；RIPA(北京索莱宝科技有限公司)；蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂和PMSF(瑞典巴塞尔罗氏集团)；β-actin、PI3K/P-PI3K、AKT/P-AKT(美国Cell Signaling Technology有限公司)；其他抗体，包括VEGF，eNOS/P-eNOS(上海Abcam有限公司)；血糖仪和血糖试纸（瑞典巴塞尔罗氏集团）；甲醇等其他常用试剂为国产分析纯，实验用水为去离子水。

2．方法

2.1  造模  小鼠腹腔注射Avertin（0.0165l g/kg），在麻醉下从背部表面去除毛发后，在小鼠中线上创建一个6 mm的全层切除皮肤伤口。用粘合剂硅胶板固定在伤口周围，并用5-0缝合线缝合。在伤口上滴下庆大霉素后，用无菌透明敷料覆盖伤口，每两天更换一次。

2.2  分组及给药  将 db/db和db/+小鼠按体重随机分为三组：db/+模型组、db/db模型组、db/db脑心通组（脑心通0.7 g/kg/d）。每组9只，给药组给予相应的脑心通药液，模型组给予等量的生理盐水，每天灌胃给药一次，连续给药17天。

2.3  生化指标检测  在给药期间，观察小鼠状态，状态良好的小鼠每两天尾尖取血并记录小鼠的空腹血糖，在给药16天后摘眼球取血并分离血清，取血清和肝脏组织研磨液，用TG、TC、LDL-C、HDL-C、Scr、ALT、BUN试剂盒测定相关的生化指标。

2.4  伤口愈合分析  用照相机对伤口闭合区进行追踪，每两天追踪一次。用Image J软件对创面闭合度进行量化，以创面愈合面积百分比表示，计算为：[1-(day X 创面面积/day 0天创面面积)]×100%。

2.5  免疫荧光评价  小鼠在处死前30 min静脉注射50 μl的Griffonia Simpli-cifolia Lectin I（1 ml HKS缓冲液稀释）。创面皮肤组织用4%聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5 μm）。石蜡切片加热60℃过夜，然后通过二甲苯和一系列分级乙醇溶液脱蜡。切片用预热抗原修复液孵育10 min，在PBS中洗涤3次后，用5%胎牛血清在PBS中室温下封闭1 h。将一抗ANTI-SOYBEAN AGGLUTININ ( PBS缓冲液稀释1:100)与切片在4℃下隔夜孵育，二抗DyLight®594 ANTI-GOAT IgG (H+L) (PBS缓冲液稀释1:200)在室温黑暗环境中孵育20 min。用抗荧光衰退淬灭剂封片，在倒置荧光显微镜下观察。

2.7  Western blotting  将组织放入预冷的裂解液中（10 ml裂解液：10 ml RIPA + 0.1 g 蛋白酶抑制剂 + 0.1 g磷酸酶抑制剂 + 50 μl PMSF），研磨破碎，4℃ 离心， 12000 rpm/15 min，吸取上层上清液，BCA法测定蛋白浓度，定量。在10% SDS-PAGE上分离每个样品，并将其转移到PVDF膜上。在TBST中用5%牛血清白蛋白或脱脂牛奶(TBS中用0.1% Tween-20)封闭3 h后，在4℃下与各自的一抗孵育过夜，后用TBST彻底洗涤。然后，将膜与二抗辣根过氧化物酶（1：10000）在室温下孵育1 h。用增强的化学发光检测试剂进行印迹检测。用Image J量化蛋白条带的灰度强度，并与每个样品中的β-actin进行归一化。

2.8  统计分析  统计分析使用SPSS软件进行。实验的结果用`x±SD 表示。用T检验比较两组之间的差异。采用单因素方差分析（ANOVA）对两个或两个以上独立组的各参数进行比较。P＜0.05的值有统计学意义。

3. 结果

3.1  脑心通胶囊对糖尿病小鼠伤口愈合的影响   术后给药16天后，与正常小鼠的伤口愈合相比，糖尿病模型组小鼠在组织损伤后的伤口愈合速率明显降低（P＜0.05或P＜ 0.01），在糖尿病小鼠中，脑心通组与模型组相比较，损伤后10-14天伤口愈合率脑心通组明显高于模型组（P＜0.05），说明脑心通能明显促进伤口愈合速率，见图1.

图1. 脑心通对db／db小鼠伤口愈合的影响  （A）创伤后伤口愈合照片。（B）0～16天伤口闭合面积百分比。*P＜0.05，**P ＜0.01  vs  db/+ Model，#P＜0.05， vs db/db Model（`x±SD，n＝8）。

3.2  脑心通对糖尿病小鼠的体重、血糖和生化指标的影响  如图二所示，与db/+相比较，db/db小鼠的体重和血糖均高于db/+小鼠，而脑心通给药组与db/db模型组相比，体重和血糖均没有明显变化。TG、TC、LDL-C、HDL-C、Scr、ALT、BUN是糖尿病糖脂代谢代谢相关的重要的产物，在表1中，在伤口愈合的过程中给药组与模型组没有差别，说明脑心通对伤口愈合期间糖尿病小鼠的糖脂代谢没有影响。

图2. 脑心通db／db小鼠体重、空腹血糖的影响  （A）db/+ Model、db／db Model与db/db NXT组体重变化。（B）db/+ Model、db／db Model与db/db NXT组空腹血糖化（`x±SD，n＝8）。

Table1: 脑心通对小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、Scr，肝脏ALT和肾脏BUN的影响（`x±SD，n＝8。）

3.3  脑心通对伤口边缘血管密度和VEGF的表达的影响   如图3-5所示，与正常的小鼠相比，db/db 模型组伤口周围的血管密度和毛细血管密度明显降低（P＜0.01），而db/db脑心通组与模型组相比，伤口周围的血管密度和毛细血管密度也明显增加（P＜0.05），western blotting的结果显示，与正常组相比，在组织损伤7天时，db/db模型组VEGF表达量明显降低，而db/db脑心通组与db/db模型组相比,VEGF的表达量明显增加。

图3： 脑心通对db/db小鼠伤口边缘血管密度的影响（`x±SD，n＝6）

图4： 脑心通对db/db小鼠伤口边缘毛细血管的影响  （A）损伤后7天Lectin免疫荧光染色。（B）损伤后7天Lectin免疫荧光染色的量化。*P＜0.05 and **P＜0.01 vs db/+  Model, #P＜0.05 vs db/db Model,（`x±SD，n＝6）。

图5： 脑心通对db/db小鼠伤口周围组织VEGF表达的影响 （A）损伤后7天组织中VEGF的表达。（B) A图的量化。**P＜0.01 vs db/+  Model, ##P＜0.01 vs db/db Model,（`x±SD，n≥3）。

3.4  脑心通对PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响   在图4中，与正常小鼠相比，db/db模型组的PI3K磷酸化明显降低（*P＜0.05 and **P＜0.01） ，而db/db脑心通组与db/db模型组相比PI3K、AKT和eNOS磷酸化明显增加（#P＜0.05 and ##P＜0.01），说明脑心通能促进PI3K、AKT和eNOS的磷酸化，从而激活PI3K/AKT/eNOS信号通路。

图6： 脑心通激活AKT/eNOS/VEGF信号通路的影响 （A）组织损伤7天后，伤口边缘区域PI3K/P-PI3K、AKT/P-AKT、eNOS/P-eNOS Western blotting 结果。（B-D）A图的量化。*P＜0.05 and **P＜0.01 vs db/+ Model，#P＜0.05 and ##P＜0.01 vs db/db Model, （`x±SD，n≥3）。

4讨论

伤口愈合是一系列复杂而有序的病理过程，需要多种细胞的参与，它们之间相互作用共同参与损伤修复。正常的伤口愈合主要包括三个过程：炎症、组织新生及重塑，各个过程相互联系而且没有明显的界限。当机体出现损伤时，首先是一些炎症细胞，包括中性粒细胞、单核细胞和肥大细胞，聚集到伤口表面，释放细胞因子，并刺激生长因子的释放和促进细胞外基质的降解，从而促进各种细胞，主要是成纤维纤维细胞的增殖和迁移，形成肉芽组织，最后肉芽组织变薄，细胞外基质的聚集和沉积形成瘢痕^[11-14]。在肉芽组织的形成过程中，细胞的增值和迁移所需的氧气和营养物质需要血管的运输，因此血管新生在肉芽组织的形成过程中发挥了很大的作用,但是在糖尿病环境下，微血管损伤，血管新生受损，与之相关的反应受到阻碍导致伤口愈合推迟^[15]。脑心通是在经方补阳还五汤的基础上加入乳香、没药、丹参、鸡血藤增加其活血化瘀作用，临床上用来治疗心血管疾病的方剂。以前的研究发现脑心通在高血脂症和高血糖症患者中具有抗糖尿病的作用，而且对糖尿病肾病有明显的抑制作用^[10]。本实验中，我们用db/db小鼠,建立切除性创面夹板模型，该模型将夹板紧密地贴附在创面周围的皮肤上，通过减少由于皮肤收缩和创面敷料引起的变化，实现创面均匀闭合，使伤口愈合过程类似于人类伤口愈合的过程^[16]。研究结果显示在伤口愈合的过程中脑心通能激活AKT/PI3K/eNOS信号通路，增加VEGF的表达，促进血管新生从而加速Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合。

体重、空腹血糖及相关代谢生化指标是糖尿病的重要指标，长期服用脑心通能降低糖尿病小鼠血清中TC、LDL-C、TG、BUN的含量,增加VLDL-C、CRE的含量^[14]。我们的结果显示在伤口愈合的过程中脑心通对糖尿病小鼠的体重，血糖和生化指标并没有影响，可能是因为我们的给药时间只有17天，对糖尿病小鼠的生化指标并没有影响，说明在伤口愈合过程中脑心通并不是通过改变糖尿病小鼠的代谢来加速糖尿病伤口的愈合。

血管新生是伤口愈合中非常重要的一步，血管的生成为组织新生提供了所需营养物质,正常伤口愈合中，血管生成取决于促血管生成因子和抗血管生成因子之间的动态平衡，血管生成因子平衡的破坏有助于血管形成，抗血管生成因子的增加抑制血管的形成,VEGF是促进血管新生重要蛋白分子，VEGF与其受体结合后可促进血管的生长,而且增加VEGF可以加速糖尿病小鼠的创伤愈合^[17-19]。我们的研究表明，脑心通能增加急性心肌梗死小鼠缺血区血管新生，促进缺血区内皮细胞的动员与归巢和VEGF的表达^[9，21]。本研究中，脑心通明显增加糖尿病小鼠伤口边缘血管密度和VEGF的表达，这说明脑心通可能通过促进血管新生加速Ⅱ型糖尿病小鼠伤口愈合。

为了进一步探究脑心通对血管新生的作用机制，我们探讨了脑心通是否能激活PI3K/ AKT/eNOS信号通路。PI3K/Akt/eNOS信号通路是激活酪氨酸激酶信号通路,当VEGF与内皮细胞表面受体的结合能激活细胞内酪氨酸激酶，触发多种促进血管生成的下游信号,大量的证据表明PI3K/Akt/eNOS相关的信号通路参与内皮细胞的存活与增值，从而促进血管新生^[20]。PI3K的磷酸化能刺激诱导下游蛋白Akt的磷酸化,磷酸化的Akt导致其下游eNOS底物的激活，从而改善NO的产生，NO是维持内皮细胞生物学功能的基本分子^[21]。我们的结果表明脑心通能促进PI3K、AKT和eNOS磷酸化，从而激活PI3K/AKT/eNOS信号通路，增加VEGF的表达，促进血管新生和伤口愈合。

综上所述，脑心通通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路，增加VEGF的表达，进而促进血管新生，加速糖尿病组织新生和伤口愈合，这可能作为治疗Ⅱ型糖尿病伤口愈合潜在的一种治疗方法。

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