自拟健脾养血汤对特异性皮炎小鼠模型中Toll样受体的表达影响及意义

              白书仙 卫静 贺琪 龙剑文 石全 李恒

（湖北省中医院皮肤科，武汉，430061）

目的 观察自拟健脾养血汤剂对特异性皮炎（AD）小鼠模型皮肤炎症症状和Toll样受体表达的影响。方法 通过外用2，4-二硝基氟苯（DNFB）丙酮制备特异性皮炎小鼠模型，小鼠随机分为正常对照组（n=10）、模型组（n=10）和健脾养血汤剂治疗组（n=10）。造模后 10天各组皮炎症状打分，使用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组皮肤组织中TLR2、TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组和健脾养血汤治疗组皮炎症状显著，TLR2、TLR3、TLR4、TLR9mRNA均明显上升，表达显著增高（P<0.05）。与模型组比较，健脾养血汤治疗组皮炎症状显著减轻，TLR2、TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达均降低（P<0.05）结论 健脾养血汤剂可通过抑制TLR2、TLR3、TLR4、TLR9表达，改善特异性皮炎临床症状。

关键词 特异性皮炎  Toll样受体 健脾养血汤

Objective To observe the effects of  strengthening the spleen and nourishing blood decoction on skin inflammation and toll-like receptor expression in Atopic dermatitis (AD) mice.  Methods A model of Atopic dermatitis was established in mice by applying of 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB)to the skin,the mice were randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=10) and strengthening the spleen and nourishing blood decoction group (n=10). The dermatitis symptoms of each group were scored 10 days after modeling, and the expressions of TLR2, TLR3, TLR4 and TLR9mRNA in the skin of each group were detected by real-time quantitative PCR. Results  Compared with the normal group, the dermatitis symptoms in the model group and the strengthening the spleen and nourishing blood decoction group were significant, and the expression of TLR2, TLR3, TLR4, and TLR9mRNA were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the dermatitis symptoms were significantly reduced in the group treated with the strengthening the spleen and nourishing blood decoction, and the expressions of TLR2, TLR3, TLR4 and TLR9mRNA were all decreased (P<0.05). Conclution The strengthening the spleen and nourishing blood decoction can improve the clinical symptoms of Atopic dermatitis through TLR2, TLR3, TLR4 and TLR9.

特异性皮炎（Atopic dermatitis，AD），又称遗传过敏性皮炎，是常见的一种慢性的非特异性皮肤炎症。目前发病机制尚不明确，目前认为，免疫炎性反应在发病过程中发挥了重要作用^[1]。

Toll样受体（(Toll-like receptors，TLRs）介导的免疫反应在机体免疫应答过程中发挥重要作用^[2]。目前，TLRs与AD发病的联系成为研究热点。有研究表明，Toll样受体参与AD免疫反应和炎症反应过程，与疾病的严重程度相关。在本文中，我们通过BABL/c小鼠建立AD的动物模型，观察自拟健脾养血汤对特异性皮炎小鼠模型中Toll样受体的表达影响情况。

1实验材料与方法

1.1 主要试剂

Total RNA 提取试剂（RNAiso Plus）购买于日本TAKARA公司，5×PrimeScript®RT Master Mix逆转录试剂盒购买于TAKARA公司，SYBR®Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购买于TAKARA公司。2，4- 二硝基氟苯（DNFB）购于美国sigma 公司。

1.2 动物模型制备

BABL/c雌性小鼠进入实验室后，标准饲料饲养1周后进入实验。参照Heller 等^[3]的方法制备AD小鼠模型。实验前1天，以剃刀剃除小鼠背部面积约2 cm×3 cm毛发，于剃毛处外涂100微升0．5％DNFB进行诱导。连续10天，造模成功后，模型组小鼠背部皮肤表现为红斑、增厚、结痂，皮肤干燥，可见干裂。

1.3 实验药物制备

健脾养血汤水煎液配方为：党参15g，茯苓20g,白术15 g，黄芪30g, 白鲜皮20g,地肤子20g，土茯苓30g，当归20 g，制首乌10g,荆芥10g,防风10g,乌梅15g,五味子15g，甘草10g。

1.4 实验分组

BABL/c雌性小鼠 (武汉大学实验动物中心提供)30只，体重15-20g。按照随机数字表将实验动物分为随机分为正常对照组、特异性皮炎模型组、中药治疗组，每组10只。正常对照组和特异性皮炎模型组予生理盐水灌胃，中药模型组健脾养血为10ml/kg。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定各组TLR2、TLR3、TLR4、TLR9表达

RNA制备试剂盒提取皮肤组织总RNA，采用TAKARA逆转录及实时荧光定量试剂盒检测Toll样受体mRNA的表达，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)作为内参对照。反应参数：95℃变性4 min；95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 延伸 5 min。每个样本设置3个复孔，使用StepOne Software v2.1软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct（Threshold cycle）值，CT值代表荧光实时定量PCR的结果, ΔCT=CT（目的基因）-CT（内参基因），ΔΔCT=ΔCT（实验组）-ΔCT（对照组）。根据公式可以算出各组细胞中目的基因表达/对照组细胞中目的基因表达=2-ΔΔCT表示^[4]。采用primer premier 5.0软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。具体序列如下：TLR2（上游引物:5'- GCTCCTGCGAACTCCTATCC-3'，下游引物:5'- CAGCAGACTCCAGACACCAG-3'）；TLR3（上游引物:5'- GGCAGCAGGTGGAATTTGTAT-3'，下游引物:5'- CCAAGTTGCCGTTTCTTGTT -3'）；TLR4（上游引物:5'- GCTCACGCGCAGACACATCC-3'，下游引物:5'- CAGCACACTTCAAGACCCAG-3'）；TLR9（上游引物:5'- GGCGCAGGATGGAATTTGTAT-3'，下游引物:5'- CCAAGTACGTACGTTCTTGTT -3'）；GAPDH（上游引物:5'- CAGCAAGGACACTGAGCAAGA -3'，下游引物:5'- GCCCCTCCTGTTATTATGGGG -3'）。

1.6 皮肤炎症分数检测

造模10天后皮肤炎症的分数，评估皮损处水肿、红斑和出血的严重程度进行评分^[5]。（0 分，无；1 分，轻微；2 分，适度；3 分，严重）。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，数据以±S表示，采用两样本的t检验法进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.荧光定量PCR法检测各组TLR2、TLR3、TLR4、TLR9表达

图1显示，模型组小鼠皮肤组织中TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达明显升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)。治疗组皮肤组织TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达较模型组降低，差异有统计学意义(P<0．05)。

图1：实时荧光定量聚合酶链反应测定TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达，数据结果以±S表示（n=10, *: P<0.05 for 正常对照组vs 模型组，#: P<0.05 for 治疗组vs 模型组）

2.健脾养血汤剂对皮肤炎症分数的影响

正常组皮肤炎症分数为0，模型组为（2.1±0.3），治疗组为（1.4±0.2）。模型组分数较正常组显著增高（P<0.05），健脾养血汤剂治疗组皮肤炎症分数低于模型组（P<0.05）。

讨 论

特应性皮炎是一种与遗传及免疫相关的复发性炎性皮肤病，以剧烈瘙痒、皮肤屏障异常、以及多种致病微生物如金葡萄球菌、真菌及某些病毒的定植与感染为特征，发病机制尚不明确。有研究表明AD患者的发病与Toll样受体密切相关。Toll样受体目前在感染性皮肤病如带状疱疹、麻风病、念珠菌病、皮肤利什曼病及一些皮肤免疫相关疾病中成为研究热点^[6]。本研究也发现在特异性模型组中TLR2、TLR3、TLR4及TLR9mRNA水平较正常对照组明显增加，说明TLR2、TLR3、TLR4和TLR9可能参与了特异性皮炎发病过程中的免疫反应。

Toll样受体是一种模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，它可以通过识别、结合外界病原体的病原相关分子模式(pathogen．associated molecular patterns，PAMPs)和机体组织损伤相关分子模式(damage．Associated molecular patterns，DAMPs)，激活下游信号通路，启动依赖性髓样细胞分化因子88（myelold differentiation factor,MyD88）和非依赖性MyD88的β干扰素TIR结构域衔接蛋白（Toll/IL-1receptor domain containing adaptor inducing IFN-β,TRIF）信号转导途径，诱导NF-κB核转录，刺激促炎细胞因子的产生^[2]。因此，采取干预TLR信号通路进而抑制下游产生的过多的炎性因子可能成为一种治疗特异性皮炎的策略。我们通过健脾养血汤治疗特异性皮炎小鼠发现TLR2、TLR3、TLR4及TLR9mRNA水平较模型组均明显下降，皮炎炎症分数也相应降低，说明健脾养血汤可以抑制TLR2、TLR3、TLR4及TLR9mRNA表达进而产生抗炎作用。

西医治疗特异性皮炎多使用含有糖皮质激素的软膏治疗效果较好，但长期使用会带来如皮肤变薄、毛细血管扩张、多毛、病情反复发作等许多不良反应^[7]。中药一直广泛用于治疗皮肤疾病，而且临床研究结果表明中药是有效、安全的治疗方法之一。我们的研究结果提供了健脾养血汤通过抑制Toll样受体治疗特异性皮炎的理论依据。总之，我们在动物体内证实健脾养血汤抑制Toll样受体的作用，但其抑制作用还需在特异性皮炎患者体内得到进一步证实。

参考文献：

[1] 罗金成, 宋志强. 特应性皮炎的发病机制[J]. 中华临床免疫和变态反应杂志, 2017, (4).

[2] Kawasaki T, Kawai T. Toll-Like Receptor Signaling Pathways[J]. 2014, 5(461): 461.

[3] Heller M, Shin HT, Orlow SJ, et al. Mycophenolate mofetil for severe childhood atopic dermatitis: experience in 14 patients[J]. Br J Dermatol, 2007, 157(1): 127–132.

[4] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature protocols, 2008, 3(6): 1101-1108.

[5] Oranje AP. Evidence - Based Pharmacological Treatment of Atopic Dermatitis: An Expert Opinion and New Expectations[J]. Indian journal of dermatology, 2014, 59(2): 140-142.

[6] 卜今, 马鹏程. Toll样受体和某些皮肤病的关系[J]. 国际皮肤性病学杂志, 2005, 31(4): 259-261.

[7] 贺晓瑛, 周婷, 谢菲. 治疗特应性皮炎的新药——Eucrisa[J]. 临床药物治疗杂志, 2017, 15(5): 6-9.