沉默GRP78增加非小细胞肺癌对吉西他滨的敏感性

王志静，苏荣健，杜晓媛

（锦州医科大学基础学院病理学教研室，辽宁 锦州 121000）

文章已被中国临床药理学杂志社录用，中国临床药理学杂志投稿网址链接：http://www.zazhi114.cn/zhongguolinchuangyaolixue

摘要:

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对非小细胞肺癌(NSCLC)，吉西他滨化疗的敏感性影响。方法：应用免疫组织化学方法检测GRP78在32例经吉西他滨治疗的NSCLC患者手术切除肿瘤组织中的表达，分析GRP78的表达水平与化疗效果的关系；应用RNA干扰技术下调SPCA1细胞中GRP78的表达，应用MTT、克隆形成实验检测肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性，并应用Western Blotting法检测Akt、PI3K的表达及磷酸化水平。结果：免疫组织化学实验结果显示在吉西他滨治疗的12例缓解的患者中，有5例GRP78过表达（5/12, 41.7%）；在20例未缓解的NSCLC中，有17例GRP78过表达（17/20, 85.0%）。MTT和克隆形成实验结果显示沉默GRP78增加SPCA1细胞对吉西他滨的敏感性，抑制Akt、PI3K的磷酸化水平。结论：GRP78通过PI3K/Akt途径降低NSCLC对吉西他滨的敏感性。

关键词:非小细胞肺癌；葡萄糖调节蛋白78；吉西他滨；化疗敏感性

Silencing GRP78 increases the sensitivity of gemcitabine in Non-small Cell Lung Cancer

WANG Zhijing，SU Rongjian，DU Xiaoyuan

(Department of Pathology, School of Basic Sciences, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning)

ABSTRACT

Objective: To investigate the sensitivity of glucose-regulated protein 78 (GRP78) to gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods: The relationship between the expression of GRP78 and the effect of gemcitabine in 32 cases of non-small cell lung cancer tissues after surgical resection was analyzed by immunohistochemistry. The expression of GRP78 in SPCA1 cells was down-regulated by RNA interference. MTT and clone assay were used to examine the sensitivity of gemcitabine on SPCA1 cells, and Western Blotting was performed to detect the expression and phosphorylation of Akt and PI3K. Results: Immunohistochemistry showed GRP78 were over-expressed in 5 out of 12 cases of NSCLC relieved by gemcitabine (41.7%) and 17 out of 20 cases of NSCLC unrelieved by gemcitabine (85.0%). MTT and clone assay showed Silencing GRP78 increased the sensitivity of gemcitabine in SPCA1 cells and decreased the phosphorylation levels of Akt and PI3K. Conclusion: GRP78 reduced the sensitivity of gemcitabine in NSCLC via the PI3K/Akt pathway.

KEYWORDS: NSCLC; GRP78; Gemcitabine; Chemosensitivity

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占肺癌患者的75%～80%^[1]。尽管目前多学科综合治疗，包括靶向药物、抗体与化疗药物，使得NSCLC的治疗效果有所改善，但总的患者5年生存率仍然偏低，仅为10%～15%^[2]。其中化疗是NSCLC临床治疗的主要手段，其常用药物之一为吉西他滨。吉西他滨（gemcitabine, GEM）属于二氟核苷类抗代谢类抗癌药，以其为基础的联合化疗能有效提高NSCLC患者的生存率^[3]，但其耐药性限制了临床疗效，并且目前缺乏有效的指标来预测NSCLC对吉西他滨的耐药性。因此，筛选与吉西他滨耐药性相关的分子标志成为目前研究的重点。

葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）在恶性肿瘤细胞中过表达，而在正常细胞中低表达甚至不表达。目前的研究显示GRP78过表达可以导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐药^[4]，但其是否与NSCLC对吉西他滨的耐药有关目前报道较少。在NSCLC发生发展过程中，发现PI3K/Akt信号传导通路中PI3K由于某种因素异常活化，激活Akt，活化的Akt进一步激活下游各种信号分子，调控肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药性等^[5] [6]。通过削弱这种因素是否可以逆转肿瘤细胞耐药性是本文探讨的重要内容。

本研究通过对GRP78在经吉西他滨治疗的NSCLC患者手术切除组织中的表达水平和治疗效果进行分析，并在此基础上在过表达GRP78的肺腺癌细胞系SPCA1中应用RNA干扰技术下调GRP78的表达，观察GRP78对吉西他滨化疗敏感性的影响，从而为临床上增加吉西他滨在NSCLC化疗的敏感性提供新的线索。

1资料与方法

1.1临床标本：收集锦州医科大学附属第一医院2015年1月～2017年1月手术切除并经病理证实的石蜡包埋NSCLC组织标本35例，中位年龄60岁，手术时未进行放化疗治疗。35例患者中能评价疗效者32例，均在化疗2周期后予以全面检查，进行疗效评估；另外3例仅行化疗1周期，不进行疗效评估。治疗方案：成人推荐吉西他滨剂量为1000mg/m²，静脉滴注30min，每周1次，连续3周，随后休息1周，每四周重复1次，依据病人的毒性反应相应减少剂量。疗效评价：采用实体瘤疗效评价法（RECIST）对化疗效果进行评价，疗效评价分为CR、PR、SD和PD；缓解包括CR和PR，未缓解包括SD和PD。

1.2 主要试剂和仪器：人肺癌细胞系SPCA1、A549、H3255由北京生命科学研究院陈良研究员惠赠。SP试剂盒和DAB试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。GRP78-shRNA购于GenePharma公司，Lipofectamine2000购于Invitrogen公司。吉西他滨购于美国Selleck chemicals公司（批号：S171403）。GRP78、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、β-actin抗体购于美国CST公司。HRP标记的二抗、ECL发光试剂购于碧云天公司。

1.3 免疫组化染色：二甲苯和梯度乙醇脱蜡、枸橼酸钠缓冲液高压修复，过氧化氢孵育封闭内源性过氧化酶，GRP78抗体1:200稀释，4℃过夜。次日，滴加二抗，37℃孵育40min，DAB显色，苏木精复染，分化，脱水，封片。GRP78蛋白在细胞质中表达，以抗体在细胞质中出现棕黄色或棕褐色判定为阳性反应，对结果进行半定量分析。染色强度评分：0分（无着色），1分（淡黄色），2分（棕黄色），3分（棕褐色）；染色阳性率评分：0分（阴性），1分（≤25%），2分（25～50%），3分（51～75%），4分（≥75%）。以“染色强度评分”和“染色阳性率评分”的乘积作为总评分并进行分组，0~5分为低表达组，6~12分为高表达组。所有结果由两名资深病理科医生进行评分与核准。

1.4 细胞培养和细胞转染：SPCA1、A549、H3255细胞培养于含10% FBS和1% 青霉素/链霉素的1640培养液中，培养条件为37℃，5% CO2。每2-3天更换培养液一次。转染按Invitrogen公司的实验指南进行。将细胞接种于6孔细胞培养板中，当细胞密度达到80%时，开始转染。于转染前12小时更换培养液，将细胞培养于不含抗生素的完全培养液中。转染体系为500μl，质粒DNA与转染试剂的比例为2:5，其中质粒6μg，Lifectamine2000体积为15μl，与转染后48小时应用免疫印迹技术检测转染效率。

1.5 MTT实验：实验组和对照组细胞按5000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板，12小时后，用含有吉西他滨的0.5%血清的培养液处理细胞继续培养48小时，加入MTT试剂继续培养4小时后，DMSO溶解沉淀，于490nm测定吸光度值。

1.6 克隆形成：实验组和对照组细胞按1000个细胞/孔接种于6孔细胞培养板，在培养箱中放置2周，终止培养后，甲醛固定30min，结晶紫染色15min，洗去染色液，空气风干。

1.7 Western Blotting法检测：将处理后的细胞用RIPA缓冲液（1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1% SDS、0.1% PMSF）裂解，BCA法定量，SDS-PAGE电泳，转膜，3% BSA封闭，一抗（1:1000稀释）4℃过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的二抗室温孵育1h，ECL显色。

1.8统计学处理：应用SPSS13.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用`x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析。免疫组化样本量较小，采用Fisher确切概率法对其进行分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 GRP78在经吉西他滨治疗的NSCLC患者手术切除组织中的表达 在32例经吉西他滨治疗的NSCLC患者手术切除组织中，12例经吉西他滨治疗后缓解，20例吉西他滨治疗未缓解。免疫组织化学实验结果显示，在吉西他滨未缓解组中GRP78的表达水平明显高于缓解组（图1）。GRP78表达水平在12例经吉西他滨治疗后缓解的患者手术切除肿瘤组织中，5例GRP78高表达（5/12，41.7%）；在20例未缓解患者手术切除肿瘤组织中，17例GRP78高表达（17/20，85.0%），经Fisher确切概率法分析显示差异具有显著性（p=0.018）（图2）。

图1  GRP78在吉西他滨治疗缓解和未缓解的NSCLC患者手术切除组织中的表达

Fig. The expression of GRP78 in the remission and no remission of NSCLC tissues after surgical resection by gemcitabine

A和B：GRP78在鳞癌型NSCLC化疗效果缓解和未缓解中的表达 ×200；

C和D：GRP78在腺癌型NSCLC化疗效果缓解和未缓解中的表达 ×200；

A and B: The expression of GRP78 in the remission and no remission of lung squamous cell carcinoma after chemotherapy ×200;

C and D: The expression of GRP78 in the remission and no remission of adenocarcinoma after chemotherapy ×200;

图2  GRP78在吉西他滨敏感和不敏感的NSCLC患者手术切除组织中的表达

Fig.2 The expression of GRP78 in the sensitivity and insensitivity of NSCLC tissues after surgical resection by gemcitabine

2.2  肺癌细胞的选择及RNA干扰下调SPCA1细胞中GRP78的表达

为了探讨GRP78与NSCLC对吉西他滨治疗敏感性的关系，采用Western blotting法检测A549、H3255、SPCA1中GRP78表达情况结果显示：GRP78在这3种细胞中均有表达，其中SPCA1细胞中表达水平最高，因此选定SPCA1细胞用于后续研究（图3）。RNA干扰实验结果显示与对照组shNC比较，shGRP78转染组在SPCA1细胞中GRP78表达水平明显降低（图4）。

图3 Western Blotting法检测A549、H3255、SPCA1中GRP78表达电泳图

Fig.3 Electrophoregram of expressions of GRP78 in A549, H3255, and SPCA1 cells detected by Western blotting method

图4 Western Blotting法检测RNA干扰后SPCA1细胞中GRP78表达电泳图

Fig.4 Electrophoregram of expressions of GRP78 in SPCA1 cells by RNA interference detected by Western blotting method

2.3 下调GRP78增加NSCLC细胞对吉西他滨处理的敏感性

为了探讨GRP78与NSCLC对吉西他滨治疗敏感性的关系，我们应用0、5、10、15、20和30 μmol/L浓度的吉西他滨（GEM）分别处理的shNC和shGRP78细胞，结果显示与shNC细胞相比，吉西他滨处理明显抑制shGRP78细胞的增殖，随着吉西他滨浓度的增加，增殖能力明显减低，呈现出明显的浓度依赖性（图5）。克隆形成检测结果显示：与对照组对比，转染shGRP78可以显著降低SPCA1的增殖能力，加入吉西他滨更加明显（图6）。

图5 MTT法检测RNA干扰后SPCA1细胞的增殖能力

Fig.5 Proliferative capacity of SPCA1 cells by RNA interference detected by MTT assay

图6 克隆形成法检测RNA干扰后SPCA1细胞的增殖能力

Fig.6 Proliferative capacity of SPCA1 cells by RNA interference detected by clone assay

2.4 下调GRP78抑制PI3K/Akt信号通路

为了探讨下调GRP78增加吉西他滨敏感性的分子机制，我们检测了下调GRP78对PI3K/Akt信号通路的影响，结果显示与shNC组相比转染shGRP78可以降低p-Akt、p-PI3K的表达水平，加入吉西他滨处理后p-Akt、p-PI3K表达水平降低更加明显（图7）。

图7 Western Blotting法检测各组SPCA1细胞中Akt、PI3K的表达及磷酸化水平电泳图

Fig.7 Electrophoregram of expression and phosphorylation of Akt、PI3K in SPCA1 cells in various groups detected by Western blotting method

3讨论

GRP78是一种多功能蛋白质，属于热休克蛋白70家族^[7]。GRP78 在肿瘤细胞过表达，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等生物学特性具有重要的调节作用^[8]。研究表明GRP78在多种肿瘤中可以导致肿瘤细胞对化学药物治疗抵抗^[9][10]。例如在肝细胞癌细胞中过表达GRP78可以导致肿瘤细胞对sorafenib获得性耐药的发生^[11][12]。因此GRP78与肿瘤耐药性存在密切关系，其独特的生物学特性和功能使之在肿瘤治疗中受到关注^[13,14] 。

我们的研究发现GRP78在经吉西他滨治疗耐药的NSCLC患者手术切除肿瘤组织中高水平表达，这提示我们GRP78过表达可能与NSCLC对吉西他滨的耐药性有关。

我们进一步在高表达GRP78的SPCA1细胞中沉默GRP78观察其对吉西他滨药物敏感性的影响来验证我们的假设，结果发现沉默GRP78可增强吉西他滨对SPCA1细胞的敏感性，这提示我们沉默GRP78可以增加肺癌细胞对吉西他滨的反应性。

我们还发现在SPCA1细胞中沉默GRP78可以降低Akt、PI3K的磷酸化水平，并且加入吉西他滨后Akt、PI3K磷酸化水平降低更加明显，这提示我们GRP78可以通过PI3K/Akt途径，导致NSCLC对吉西他滨耐药。

综上所述，靶向GRP78可能是潜在、高效的非小细胞肺癌患者的治疗手段，为临床实践中吉西他滨耐药提供了新的思路，但具体机制和应用价值还需进一步研究。

参考文献

［1］Ulivi P, Zoli W, Capelli L, et al. Target therapy in NSCLC patients: Relevant clinical agents and tumour molecular characterization [J]. Mol Clin Oncol, 2013, 1(4): 575-581.

［2］Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68: 7-30.

［3］Sen Shiraj, Kato Shumei, Agarwal Rishi, et al. Phase I study of nab-paclitaxel, gemcitabine, and bevacizumab in patients with advanced cancers [J]. Br J Cancer, 2018.

［4］Gifford Jb，Hill R. GRP78 influences chemoresistance and prognosis in cancer [J]. Current Drug Targets， 2018, 19(6): 701-708.

［5］Faes S, Dormond O. PI3K and AKT: unfaithful partners in cancer [J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(9): 21138-21152.

［6］Tuya Naren, Wang Yadi, Tong Lanmei, et al. Trichosanthin enhances the antitumor effect of gemcitabine in non-small cell lung cancer via inhibition of the PI3K/AKT pathway [J]. Exp Ther Med, 2017, 14(6): 5767-5772.

［7］Chen WT, Zhu G, Pfaffenbach K, et al. GRP78 as a regulator of liver steatosis and cancer progression mediated by loss of the tumor suppressor PTEN [J]. Oncogene, 2013.

［8］Su R, Li Z, Li H, et al. Grp78 promotes the invasion of hepatocellular carcinoma [J]. BMC cancer, 2010, 10(20).

［9］Parmar JH, Cook KL. Modelling the effect of GRP78 on anti-oestrogen sensitivity and resistance in breast cancer [J]. Interface focus, 2013, 3(12).

［10］DANESHMAND S, QUEK ML, LIN E, et al. Glucose regulated protein GRP78 is up-regulated in prostate cancer and correlates with recurrence and survival [J]. Hum Pathol, 2007, 3(8): 1547-1552.

［11］Li Rui, Yanjiao Gu, Wubin He, et al. Secreted GRP78 activates EGFR-SRC-STAT3 signaling and confers the resistance to sorafeinib in HCC cells [J]. Oncotarget, 2017, 8(12): 19354-19364.

［12］Chiou JF, Tai CJ, Huang MT, et al. Glucose-regulated protein 78 is a novel contributor to acquisition of resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma.Annals of surgical oncology [J]. 2010, 1(7): 603-12.

［13］Roller C, Maddalo D. The Molecular Chaperone GRP78/BiP in the Development of Chemoresistance: Mechanism and Possible Treatment [J]. Frontiers in pharmacology, 2013, 4(10).

［14］Jenifer B. Expression of GRP78 Master Regulator of the Unfolded Protein Response Increases Chemoresistance in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma [J]. American Association for Cancer Research, 2016, 10(11): 1535-7163.