胶体金免疫层析法检测血清中类风湿因子

姚玉淑¹， 肖立娇²，边桦³

摘　要 ： 目的 建立一种快速、简易的检测类风湿因子(RF)的胶体金免疫层析法。 方法 利用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备检测RF的胶体金免疫层析试纸条，并观测该法的敏感性、特异性和稳定性。与免疫比浊法对比检测 201例临床标本。结果 该法能进行快速床旁检测 ，检测RF的最低检出浓度为12.5IU/ml； 与免疫比浊法比较，总一致性百分比为99.24%。 结论 本法简便、快速 ，特异性、灵敏度及稳定性均较好 ，适用于基层单位标本的快速筛查 。

关键词：类风湿因子（RF ）； 胶体金；  免疫层析法

Abstract: Objective To establish a fast and simple method of colloidal gold immunochromatography for detecting rheumatoid factor( RF). Methods The colloidal gold immunotometry test paper of RF was prepared by the reduction method of chloroauric acid-trisodium citrate, and the sensitivity, specificity and stability were analyzed. Compared with immunoturbidimetric method, 201 clinical specimens were examined. Results The method could be used for rapid bed detection, and the lowest detection concentration of rheumatoid RF was 12.5 IU/ml. Compared with the immuno-turbid method, the total consistency percentage is 99.24 %. Conclusion This method is simple, fast, specific, sensitive and stable for rapid screening of grass-roots unit specimens.

Key words: Rheumatoid factor (RF)；Colloidal gold ；Immune chromatography

类风湿关节炎（Rheumatoidarthritis，RA)是一种以滑膜炎为主要病理学特征的慢性疾病，最终造成软骨及骨的侵蚀、破坏及关节畸形，甚至长期残疾^［１］。RA好发于女性，发病率为男性的2~3倍，它可发生于任何年龄。早期诊断、治疗对RA缓解病情和预后意义重大^［2］，检测RF对于RA的诊断、分型和疗效观察有重要意义。本文采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备制备胶体金,包被人变性IgG制备免疫层析试纸条，与免疫比浊方法进行比较，其特异性和灵敏度均满意，具有快速、操作简便、设备简单等优点，更适于基层单位应用临床应用。

材料与方法：

1.实验材料

1.1 鼠IgG、变性人IgG、羊抗鼠IgG二抗，均由潍坊百诺迪生物科技有限公司提供。

1.2 牛血清白蛋白（BSA）、硝酸纤维素膜（Sartorius CN140）、玻璃纤维纸、吸水滤纸、PVC底板、塑料卡壳等辅料和耗材，均购自杭州毕肯莱博生物科技有限公司。

1.3 所需化学试剂分别购自国药集团化学试剂有限公司和Sigma-Aldrich公司。

2.方法

2.1 胶体金的制备及鉴定

采用常规的氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将氯金酸溶液（1%）和柠檬酸三钠溶液（1%）按不同比例混合煮沸，将烧制的胶体金用紫外-可见光分光光度计（岛津UV-2450）进行全波长扫描，确定最大吸收峰。

2.2胶金垫的制备

2.2.1 标记量和标记pH值的选择

取5×5支洁净小试管，各加入1ml胶体金，纵向用0.2mol/L K2CO3分别调节pH值至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后横向分别加入不同浓度的鼠IgG 50μl，使其终浓度分别为5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml，混匀后室温静置反应15min，然后向各管中加入100μl 10%NaCl溶液，观察颜色变化，以不变色的最低标记量和标记pH为饱和标记量和最佳标记pH。

2.2.2 封闭、离心纯化和复溶

标记鼠IgG后，加入1/10体积的10%BSA溶液（终浓度1%）封闭，混匀并静置15min，于8℃，8000rpm离心20min，达上清清澈，弃上清后用含0.1mol/L Tris＋10%蔗糖＋1%PVP＋1%BSA＋0.5%Tween-20（pH=8.5）的复溶液按不同比例悬浮沉淀，5μl/cm喷涂在玻璃纤维膜上，37℃鼓风干燥1h，制作胶金垫。根据试纸的灵敏度和特异性表现，确定最佳复溶比例。

2.3 包被硝酸纤维素膜的制备

用0.02mol/L的 PBS（pH=7.4）分别将“变性人IgG”和羊抗鼠IgG稀释至不同浓度，1μl/cm划线在硝酸纤维素膜上，37℃烘干1h，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色情况，确定最佳包被浓度。

2.4 胶体金试纸条的组装

将包被膜和胶金垫配以样品垫、吸水滤纸、PVC底板等制作成大板，然后用切条机切割成一定宽度的试纸条，装卡，即为RF胶体金免疫层析试纸条。

2.5.性能评估

2.5.1特异性

采用Roche公司的类风湿因子检测试剂盒（免疫比浊法）筛选获得20份RF阳性临床样本和20份RF阴性临床样本，用于评估胶体金试纸的特异性。 

2.5.2灵敏度

采用WHO Reference Reagent “Rheumatoid Arthritis Serum, Human”(NIBSC code: W1066)评估胶体金试纸的灵敏度。将W1066冻干粉溶解，配置成100IU/ml浓度，用生理盐水依次倍比稀释后检测，直至结果为阴性。

2.5.3临床效果一致性评价

收集无溶血、无黄疸、无高血脂、高中低值均匀分布的RF阳性样本70例和RF阴性样本131例，用于评价RF胶体金法与常规方法学（免疫比浊法）临床检测效果的一致性。其中免疫比浊法（ cut off=14IU/ml）做对照 ，高于cut off值判阳性， 低于cut off值判阴性；RF胶体金法的包被检测线(T线)和包被质控线(C线)同时显色判阳性，只有C线显色 ，判阴性，C线不显色，结果无效。

2.5.4稳定性

试纸条分别置于干燥器内37℃、室温、4℃条件下密封保存，放置不同时间并观察结果。

3.结果

3.1胶体金制备及鉴定

用紫外-可见光分光光度计（岛津UV-2450）进行全波长扫描显示，胶体金在532nm波长处有单一吸收峰，可推测胶体金粒径约40nm。

3.2胶体金试纸条工艺优化参数

鼠IgG标记量为10μg/ml；标记pH为8.0；胶体金标记物复溶比例为50μl/ml；包被检测线(T线) 为“变性人IgG”浓度为1.0mg/ml；包被质控线(C线)为羊抗鼠IgG二抗，浓度为1.0mg/ml。

3.3 胶体金试纸条性能

3.3.1 该试纸检测20份RF阳性临床样本，均呈明显的阳性反应；检测20份RF阴性临床样本，结果均为阴性，说明该试纸特异性良好。

3.3.2 该试纸检测WHO标准品W1066，灵敏度为12.5IU/ml。

3.3.3 在临床效果一致性评估实验中，胶体金法与比浊法比较：阳性一致性百分比为100%；阴性一致性百分比为99.24%；总一致性百分比为99.24%。用Kappa一致性检验分析，两种方法的检测结果具有极强的一致性。

两法比较结果

3.3.4试纸条分别在干燥、室温、4℃条件下密封保存，放置不同时间后，观察5个月新旧试纸条阴阳性结果，未发现其敏感性和特异性有所变化，说明该试纸条稳定性较好。

4. 讨论

类风湿因子(rheumatoid factor，RF)是一种抗变性IgG分子Fc段的自身抗体，它是RA诊断的标准之一，资料显示血清中RF阳性的RA患者常有病情活动，关节骨质破坏较多且严重，关节功能差^［3］。RF型别主要是IgM、IgG、IgA^[4]。目前检测RF方法主要为胶乳凝集法、散射比浊法和ELISA法等。ELISA法和散射比浊法特异性及灵敏度较高，但ELISA法操作复杂，散射比浊法仪器比较昂贵，试剂成本较高，乳胶凝集法因简便易行是广泛应用的一种方法，但灵敏度较差，易受多种因素影响。

免疫胶体金技术始于20世纪70年代初期，它是金标记技术与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式。免疫层析试纸条是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上新发展起来的新型检测技术^[5]。适合床旁的快速检测。

我们成功制备出RF胶体金免疫层析试纸条，其检测结果与免疫比浊法进行比较一致性较高，但由于不同方法学工艺原理不同、原材料来源有差异等，有时对同一份样本检测结果或强度可能会存在一定的差异性，表现出不同的敏感性和特异性，临床应用时可以实现两种方法优势互补。

我们基于RF既可以与变性人IgG的Fc端结合又可以与鼠IgG的Fc端结合的理论基础，通过改进原理设计，标记采用鼠IgG，包被采用变性人IgG，这样就可以有效避免由疫苗免疫而引起的一些个体RF检测假阳性问题，它具有快速、操作简便、设备简单特点，具有良好的临床应用前景。但需进一步提高RF胶体金免疫试纸条的敏感性、特异性和实现半定量、定量的检测。 

5.参考文献

[1].李晶,刘升云. 关节超声在类风湿关节炎评估中的应用［Ｊ］．河南医学研究,2015，24(5):70-71.

[2]. 邹旭美,陆焱胡志刚.抗-CCP诊断类风湿关节炎的临床应用分析［Ｊ］．国际检验医学杂志，2011,32（1）：120-121.

[3]. 颜向军，谢海涛．两种测定类风湿因子方法的比较[J]．南华大学学报·医学版，2007，35(2)：216．

[4]. 陈华,王永卿. 免疫透射比浊法测定类风湿因子的应用评价[J]．国际检验医学杂志，2011,29（1）：21-26.

[5]. 王玉金，杨书豪，刘丽,等. 霍乱弧菌O139胶体金免疫层析快速检测法的建立[J]．标记免疫分析与临床，2013,20(1):36-39.