高效液相色谱法同时测定生物转化肉桂醛体系中的10种天然苯基香料

黄秋容¹，粟桂娇²，梁敏¹，王一凡¹，于畅¹，马丽^1，*

（1. 广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2. 广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530005）

摘要：目的：建立了一种同时测定微生物转化肉桂醛体系中10种天然苯基香精香料（苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸、苯乙醇、苯乙酮、肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸、3-苯丙醇和3-苯丙醛）的高效液相色谱分析方法。方法：试样经无水乙醇提取，离心，过滤后进样。色谱分析采用SunFire^TMC₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇：乙腈：水：冰醋酸=28.4:18:53.6:0.04（体积比）为流动相，流速1.0 mL/min，UV-VIS检测器检测。结果：10种物质在2.002~318.6 mg·L^-1范围内线性关系良好（0.9987≤R²≤0.9996），方法检出限（LOD，S/N=3）为0.36~1.16 mg·L^-1，在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为92.13%~102.90%，RSD为0.62%~4.01%。结论：该方法简单快捷，灵敏度高，可用于微生物转化肉桂醛合成天然苯基香料的生物反应体系的成分分析，也可用于微生物转化桂醛合成天然香料的菌种选育工作中。

关键词：HPLC法；微生物转化；肉桂醛；苯基香料；筛菌

肉桂醛是我国重要林产资源——肉桂油的主要成分（约占75%~90%）^[1,2]。目前我国产的肉桂油主要是以初级香料原料出口到国外^[3]，价格低廉，严重影响了桂油相关产业的经济效益和社会效益。利用肉桂醛开发高附加值的系列新产品可带动相关产业的技术升级，意义重大。

利用微生物转化制备的香料可视为“天然品”^[4,5]，附加值大大提高，是国内外研究的热点^[6,7]。目前能运用微生物发酵工程制备的天然香料主要有天然乙偶姻^[8]、天然香兰素^[9]和天然苯乙醇^[10]等。关于以肉桂醛为底物通过微生物转化合成天然苯基香精香料的研究较少。于微生物种类的多样性，微生物转化肉桂醛体系成分十分复杂（图1），可能转化生成甲醇、苯甲醛、苯甲酸、苯乙醇、苯乙酮、肉桂醇、肉桂酸、3-苯丙醇和3-苯丙醛等苯基香精香料^[11-15]。

图1 微生物转化肉桂醛体系成分关系流程图

Fig. 1 flow chart of composition relationships of cinnamaldehyde transformed by microorganism

目前关于微生物转化肉桂醛体系中各物质的分析方法主要有气相色谱法^[16-19]、高效液相色谱法^[20-22]和紫外-可见分光光度法^[23,24]等。这些方法大多只能测定其中的3~5种化合物，能同时检测10个组分的分析方法未见报道。因此，亟待建立一种同时测定微生物转化肉桂醛体系中10种天然苯基香精香料的分析方法，不仅可用于微生物转化肉桂醛合成天然苯基香料的生物反应体系的成分分析，而且还能用于高效转化肉桂醛合成高价值天然苯基香精香料菌株的筛选。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Waters e2695 (Separations Module) 高效液相色谱仪（美国Waters公司，配2489 UV-VIS检测器）；SunFire^TMC₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Microfuge 22R台式微量离心机（德国Beckman Coulter公司）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；Agilent 8453E紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；SB25-12YDTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

肉桂醛（AR，98%）、肉桂醇（AR，98%）、苯甲醛（AR，>98.5%）、苯甲酸（AR，>99%）均购自上海麦克林生化科技有限公司；肉桂酸（AR，98%）购自上海毕得医药科技有限公司；苯甲醇（AR，99%）购自阿达玛斯试剂有限公司；苯乙醇（AR，97%）购自ACROS ORGANICS（New Jersey，USA）；苯乙酮（GC，>99.0%）购自上海阿拉丁科技股份有限公司；3-苯丙醇（AR，98%）购自上海源叶生物科技有限公司；3-苯丙醛（AR，95%）购自国药集团化学试剂有限公司。甲醇、乙腈均为色谱级，购自德国默克公司；冰醋酸，色谱级，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸（AR，>85%）购自成都金山化学试剂有限公司。实验所用水均为超纯水。

1.2标准溶液的配制

混合标准储备液（1.000 g·L^-1）：分别准确称取10种香精香料标准品适量，用无水乙醇溶解配成2.000 g·L^-1的单组分标准储备液；然后分别移取适量体积的各单组分标准储备液于棕色容量瓶，用无水乙醇/基质溶液（v/v=1:1）定容得到1.000 g·L^-1的混合标准储备液。

混合标准工作液：准确吸取适量的混合标准储备液经无水乙醇稀释后得到质量浓度范围为2.002~318.6 mg·L^-1的一系列混合标准工作液。

1.3样品的制备

将肉桂醛生物转化液加入等体积的无水乙醇，振荡摇匀，静置5 min后用移液枪吸取2 mL液体于2 mLEP管，离心（12000 r/min，5 min，25 ℃），准确吸取1 mL上清液于10 mL棕色容量瓶，用无水乙醇定容后，再用一次性无菌注射器吸取1 mL样液过0.22 μm有机滤膜待测。

1.4色谱条件

色谱柱：SunFire^TMC₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：（30±5）℃；流动相为甲醇：乙腈：水：冰醋酸=28.4:18:53.6:0.04（体积比）；等梯度洗脱，流速：1.0 mL/min；UV-VIS检测器检测，检测波长：204 nm；进样量：10 μL。

2结果与讨论

2.1检测波长的选择

分别取“1.2”节所配置的单组分标准储备液适量，用无水乙醇稀释成质量浓度为10 mg·L^-1的10种物质单标液，以无水乙醇为空白液，通过紫外分光光度计于200~400 nm波长范围内进行全波长扫描，得各组分紫外吸收光谱图（图2）。如图2所示，微生物转化肉桂醛体系中的10种目标待测物的最大紫外吸收峰在204~272 nm之间。为兼顾各化合物的检测灵敏度，本实验选择204 nm作为检测波长。

图2 十组分紫外光谱图

Fig. 2 UV spectra of ten components

1. Benzyl alcohol; 2. Phenylethanol; 3. Benzaldehyde; 4. Acetophenone; 5. Cinnamon; 6. Benzoic acid; 7. 3-phenylpropanol; 8. Cinnamaldehyde; 9. Cinnamic acid; 10. 3-phenylpropionaldehyde.

（1.苯甲醇；2.苯乙醇；3.苯甲醛；4.苯乙酮；5.肉桂醇；6.肉桂醛；7.3-苯丙醇；8.苯甲酸；9.肉桂酸；10.3-苯丙醛）

2.2流动相的选择

流动相组成和配比是高效液相色谱分离的重要影响因素之一。本实验考察了甲醇、乙腈和纯水对生物转化肉桂醛体系中10种物质的色谱分离效果。结果发现，3种试剂无论是单独或者两两组合用作流动相均不能将体系中的10种物质完全有效分离；当流动相为甲醇：乙腈：水=28.4:18:53.6（体积比）时，各组分能实现有效分离。

在探究流动相比例的过程中，较高浓度时肉桂酸峰型较宽且出现拖尾现象，这可能是肉桂酸分子离子化造成的。加酸可抑制酸的电离。实验比较了在纯水中加入0.04%磷酸和0.04%冰醋酸对改善肉桂酸峰型的效果。结果表明，在纯水中加入0.04%的冰醋酸后，肉桂酸检测灵敏度提高，峰型变窄，拖尾现象减轻，且对其他组分无影响。因此，最终选择流动相为甲醇：乙腈：水：冰醋酸=28.4:18:53.6:0.04（体积比）。此条件下10种目标待测物在18 min内全部出峰，且分离效果良好，标准图谱见图3。

图3 十组分混标液（100 mg·L^-1）HPLC色谱图

Fig. 3 HPLC chromatogram of ten components mixed standard solution

The number denoted was the same as that in Fig.2

2.3样品提取方式的选择

考察了超声提取、振荡提取2种常见提取方式对微生物转化肉桂醛体系中各组分的提取效率的影响。取同一批次的转化液共6份，加等量无水乙醇后，加入一定量的混合标准工作液，取其中3份振荡提取3 min；另外3份超声提取3 min(超声频率40 Hz，功率30%，温度25 ℃)，静置5 min后用移液枪吸取2 mL液体于2 mLEP管，离心（12000 r/min，5 min，25 ℃），准确吸取1 mL上清液于10 mL棕色容量瓶，用无水乙醇定容，过膜，经HPLC分析后，计算加标回收率。结果表明，超声提取和振荡提取两种提取方式对微生物转化肉桂醛体系中各物质的提取效率无明显差异。为实验方便，选择振荡提取方式。

2.4方法验证

2.4.1基质效应

基质效应（ME）是指除目标测定物以外的其余组分对测定结果影响，即基质对分析方法准确性的干扰，主要表现为基质增强和基质抑制^[25-27]。微生物转化肉桂醛体系中的10种物质均为带苯环的芳香族化合物，几乎不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂。微生物转化肉桂醛转化液有培养基、底物及转化产物等物质，属于非均向、多组分混合体系。参照“1.3”方法，用培养基溶液代替转化液进行预处理，制备空白基质溶液。分别在纯溶剂和空白基质溶液加入一定量的混合标准储备液，配制浓度相同的两种检测液，同等色谱条件下检测，根据两种检测液色谱响应值考察微生物转化肉桂醛体系的基质效应，计算公式^[28-30]如下：

M_i=[（A_mi-A_si）/A_si]×100%

式中M_i为基质溶液中目标测定物的基质效应；A_mi为基质溶液中目标测定物的色谱峰面积；A_si为纯溶剂中目标测定物的色谱峰面积。当│M_i│≤20%时，可忽略而无需采取补偿措施；20%≤│M_i│≤50%为中等基质效应；│M_i│>50%为强基质效应，需采取措施补偿基质效应。微生物转化肉桂醛体系中各组分的基质效应见表1。

表1 微生物转化肉桂醛体系中各组分的基质效应

Table 1 Matrix effect of components in microbial transformation of cinnamaldehyde system

由表1可知，苯乙醇、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸基质效应小于20%；苯甲醛、苯甲酸基质效应大于50%，其他组分均为中等基质效应。采用基质匹配标准溶液作标准曲线可抵消基质效应对测定的影响，所以本实验采用无水乙醇/基质溶液来配制混合标准工作液制作标准曲线。

2.4.2线性范围与检出限

配制质量浓度为2.002~318.6 mg·L^-1的10种标准物质的混合标准工作液，在优化的条件下进行检测，以各目标测定物的峰面积（y）为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标（x，mg·L^-1），外标法定量，得到各目标测定物的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限。以信噪比（S/N）=3计算仪器检出限(LOD，mg·L^-1)，各数据见列表2。

表2 十种香精香料的线性回归方程及检出限

Table 2 Linear regression equation and detection limit of ten flavors

2.4.3加标回收率实验与精密度实验

取已知含量的样品溶液，加入低、中、高3组浓度梯度的标准品溶液，每组实验在优化条件下平行测6次，计算回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。结果表明，微生物转化肉桂醛体系中各目标化合物的回收率为92.13%~102.90%，RSD为0.62%~4.01%。说明该方法准确度高，精密度好，满足微生物转化肉桂醛体系中各目标化合物的测定要求

表3 十种香精香料的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

Table 3 Recovery rate and relative standard deviation of ten flavors (n=6)

Compound	Scalar quantity/(mg·L-1)	Average measured value /(mg·L-1)	Recovery/%	Average recovery rate/%	RSD/%
Benzil alcohol	4.16	12.46	99.21	99.73	1.40
	8.33	16.66	100.05
	20.82	29.13	99.92
Phenethyl alcohol	4.25	12.66	92.12	92.89	2.87
	8.50	16.88	94.64
	21.24	29.72	91.93
Benzoic acid	4.05	11.81	91.87	92.13	4.01
	8.09	16.01	94.87
	20.23	28.05	89.64
Benzaldehyde	4.22	12.23	90.16	95.69	3.12
	8.43	16.62	97.08
	21.08	29.48	99.84
Acetophenone	4.02	12.34	107.17	102.90	1.07
	8.04	16.16	101.05
	20.09	28.22	100.49
Cinnamaldehyde	4.10	12.32	95.18	备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《中国调味品》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复