海盐县1例O139群霍乱病例的调查检测

周晓红，徐佩华，倪燕菁，池健，朱晓微

浙江省海盐县疾病预防控制中心，浙江 海盐 314300

摘要： 目的　对海盐县2018年发现的1例O139群霍乱病例展开疫情调查和实验室病原学检测，为霍乱疫情防控工作提供参考。方法  通过流行病学调查，采集患者、密切接触者和外环境、食品检索标本共176份进行霍乱弧菌病原检测，并对菌株进行临床常用的20种抗菌药物药敏分析。结果　在病例首次粪便样本中检出O139群霍乱弧菌，DNA核酸检测该菌株霍乱弧菌O139群核酸阳性，ctxA毒力基因阳性。药敏试验结果，该菌株对多种药物（四环素、强力霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素、利福平）耐药，对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟、头孢噻吩、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星、呋喃唑酮敏感。结论　本次疫情发现的O139群霍乱病例为单个散发病例，该菌株出现多重耐药及耐药谱变化的情况需引起关注。

关键词 霍乱；调查；病原学检测

中图分类号  R183.4                文献标识码：A

2018年9月23日，海盐县肠道门诊监测中发现了1例O139群霍乱病例，这是继2007年后霍乱疫情在当地的重新发现^[1]。疫情发生后，疾控部门立即启动霍乱疫情处置应急预案，组织开展现场调查处置和实验室排查，后续没有新发病例和带菌者，9月29日病例痊愈出院。现将疫情流行病学调查和实验室病原学检测结果报告如下。

1  资料与方法

1.1  基本情况

    病例居住于海盐县武原街道某小区，属于拆迁小区。小区设计住宅625户，入住率90%左右，沿街商户20户，无餐饮商户。小区生活用水为市政管网自来水。

1.2  病例情况

   病例，男，72岁，无业在家。病例于9月20日7:00开始出现腹泻，大便性状为水样便，24小时腹泻达10余次，有腓肠肌疼痛，无腹痛，无里急后重，无呕吐，无发热。病例于9月21日8:10到县中医院肠道门诊就诊，临床诊断为其它感染性腹泻，未开展临床相关检验，采集粪便样本后送县疾控中心。9月23日上午，县疾控中心在该病例粪便样本中检出霍乱弧菌，血清群为O139，送嘉兴市疾控中心复核确认后，当天下午病例被转运至县人民医院隔离治疗。

1.3　现场采集样品：（1）粪便样本101份：病例首次及治疗后连续2次粪便样共3份，饭店工作人员粪便样本29份，密切接触者粪便样本69份。（2）病例家中和饭店环境物表涂抹样16份。（3）病例家剩余食物（榨菜）1份、农贸市场海水产品39份。（4）生活饮用水、海水河水19份。以上样本共计176份。

1.4　检测培养基和试剂

碱性蛋白胨水、TCBS琼脂、4号琼脂、M-H琼脂均由青岛高科园海博生物技术有限公司生产；弧菌抑制剂O/129纸片（10ug/mL和150ug/mL两种）、药敏试纸由杭州滨和微生物有限公司生产；霍乱弧菌O1群混合多价、稻叶型单价、小川型单价诊断血清及孟加拉霍乱弧菌O139诊断血清均为日本生研产品；革兰氏阴性细菌（GN）鉴定卡为生物梅里埃公司产

品；霍乱弧菌（O1、O139）双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、霍乱弧菌（ctxA基因）核

[作者简介]周晓红，女，本科，主任技师；研究方向：微生物检验；E-mail:365661613@qq.com 

酸检测试剂盒(荧光PCR法)由深圳市生科源技术有限公司生产。所有培养基和试剂均在有效期内使用。

1.5  检测仪器和设备

   VITEK 2 Compact 全自动细菌培养鉴定仪（法国生物梅里埃公司）、M22R低温高速离心机(美国贝克曼公司)、LABCONCO CLASSⅡ B2型生物安全柜(美国LABCONCO公司)、ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.6　检测方法

细菌的增菌、分离鉴定按照《霍乱防治手册》第六版^[2]方法进行，药敏试验采用WHO推荐的K-B纸片法，用标准的参考菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）进行质量控制，按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）2018年的标准^[3]判断结果。霍乱弧菌DNA核酸检测按试剂盒说明书，采用实时荧光PCP法进行检测，阳性判定：有特异扩增曲线且CT值≤相应试剂盒判定值。

2　结果

2.1  流行病学调查情况

病例长期与妻子居住在小区家中，除妻子外未与其它人有共同生活密切接触史，平时很少外出。病例儿子未与其共同居住，每日到病例家中吃中饭，无腹泻相关症状。病例回忆9月16日中午赴海盐县西塘桥街道某饭店参加亲戚家满月酒，共同聚餐100余人，有吃过鲈鱼、虾、牛头、带鱼和海白虾，其余回忆不清，此外无其它外出就餐史。病例否认接触过腹泻病例，否认饮生水史，否认接触阳性水源史，食用生冷食物仅有桃子，家中卫生状况较好，室内无苍蝇。据调查，该饭店所在地饮水和生活用水为市政管网自来水，近期无霍乱疫情发生。

2.2  疫情处置和控制措施

2.2.1  病例由县中医院进行传染病网络报告，县疾控中心进行突发公共卫生事件报告。

2.2.2  确定疫点1处，为病例居住地。疫点内厕所、所在楼道、楼梯进行环境卫生整治、消杀。对化粪池也进行消毒处理。

2.2.3  病例9月23日转送至县人民医院进行住院隔离治疗，给予左氧氟沙星、蒙脱石散抗菌对症治疗，病情有所好转。9月24日病例症状消失，26日开始停止抗生素治疗，26、27日2次大便采样检测未检出霍乱弧菌，29日病例治愈出院解除隔离。

2.2.4  根据流行病学调查确定家庭密切接触者，开展采样监测和医学观察，采样检测均为阴性，解除医学观察。

2.2.5  开展形式多样的霍乱等肠道传染病防控应急健康教育。县卫计局发文要求进一步加强霍乱防控工作。

2.3  实验室检测结果

    176份样品经实验室霍乱弧菌病原检测，在病例首次粪便样本中检出O139群霍乱弧菌，毒力基因阳性，病例治疗后连续2次粪便检测结果为阴性，另外173份样品检测结果也均为阴性。检出的O139群霍乱弧菌分离培养和鉴定结果如下。

2.3.1  分离培养

病例首次粪便样本经增菌分离培养后在TCBS琼脂平板上生长良好，菌落为黄色、圆形、边缘半透明而中央不透明、表面光滑、扁平稍隆起，直径2～3mm，带有粘性不易挑取；在4号琼脂平板上生长特征明显，菌落为圆形、扁平、光滑湿润，边缘整齐，半透明，中心呈灰黑色，直径2mm左右。

2.3.2  血清学鉴定

挑取可疑菌落做玻片凝集试验，与O139诊断血清发生明显凝集，生理盐水对照不凝集，与O1群多价血清不凝集，判定该菌株为O139群霍乱弧菌，送嘉兴市疾病预防控制中心鉴定得到确认。

2.3.3  生长试验和初步生化鉴定

挑选纯培养的单个菌落，涂片染色镜检为革兰氏阴性弧菌。在无盐胨水、1%Nacl、3% Nacl胨水中均生长良好，在7% Nacl、10% Nacl胨水中均不生长，氧化酶试验阳性，0.5%去氧胆酸酸钠粘丝试验阳性。 O/129敏感试验（10ug和150ug）呈抗性。在三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄，有动力。

2.3.4  生化系统鉴定

从血琼脂平板上挑取可疑菌落，按VITEK 2 Compact 全自动细菌培养鉴定仪说明，用生理盐水制备成浊度0.5～0.63的菌悬液，使用GN鉴定卡进行生化系统鉴定，生化谱为0425611150501211，鉴定结果为霍乱弧菌。

2.3.5  DNA核酸检测

采用煮沸法提取细菌的基因DNA，经实时荧光PCP法检测，结果O1群核酸阴性，霍乱弧菌O139群核酸阳性，毒力基因ctxA阳性。

2.3.6  药敏试验

    根据治疗肠道细菌性感染时常用抗生素的种类及文献报道霍乱弧菌药物敏感情况，选用下列20种药敏纸片：氨苄西林10µg/片、阿莫西林10µg/片、头孢噻肟30µg/片、头孢噻吩30µg/片、新霉素30µg/片、丁胺卡那（阿米卡星）30µg±7.5µg/片、卡那霉素30µg/片、妥布霉素10µg/片、链霉素10µg/片、四环素30µg/片、强力霉素（多西环素）30µg/片、红霉素15µg/片、多粘菌素B 300IU/片、氯霉素30µg/片、复方新诺明23.75µg SMZ/1.25µgTMP片、环丙沙星5µg/片、氟哌酸（诺氟沙星）10µg/片、左氟沙星5µg/片、呋喃唑酮（痢特灵）300µg/片、利福平5µg/片。药敏试验结果，O139群霍乱弧菌菌株对氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟、头孢噻吩、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星、呋喃唑酮敏感，对丁胺卡那、红霉素、多粘菌素B、氯霉素为中介，对四环素、强力霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素、利福平耐药。

3　讨论　　

根据流行病学调查和实验室病原学检测分析，本起疫情发现1例O139霍乱散发病例，该菌株为O139群产毒株，霍乱肠毒素ctxA阳性，但未发生死亡病例及二代病例。提示目前规范腹泻病例监测与管理，及时采样送检，迅速采取疫情处置和防控措施，对严防霍乱等肠道传染病疫情发生和蔓延，起到了很好的作用。

    近年来我国霍乱流行的一个显著特点是: 多为小范围的爆发流行及散发^[4]。回顾海盐县以往霍乱疫情资料，2005年9月至10月出现O1及O139散发病例（O1群稻叶型4例，O1群小川型1 例，O139群2例）^[5]，2007年8月出现O1群霍乱弧菌暴发疫情（小川型10例）^[1]，而本次2018年9月又出现1例O139霍乱散发病例，提示霍乱疫情在当地呈现出反复性、多样性和间隔周期不规律性。因此当前霍乱防治须坚持贯彻“常备不懈、预防为主”的工作方针，加强重点人群、环境及食品等危险因素监测工作，各级医疗机构应做好日常腹泻病例的就诊登记，在霍乱流行季节（每年5月至10月)应设置肠道门诊，对疑似或具有典型霍乱临床症状者，应重点采样和检测，做到早发现、早报告，逐步减少和消除霍乱的发生和流行。

药敏试验结果显示，该菌株对多种药物（四环素、强力霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素、利福平）耐药，对丁胺卡那、红霉素、多粘菌素B、氯霉素中度耐药，本次药物治疗可选用喹诺酮类（环丙沙星、氟哌酸、左氟沙星）、头孢类（头孢噻肟、头孢噻吩）、青霉素类（氨苄西林、阿莫西林）抗生素。O139群霍乱弧菌的耐药情况比较复杂^[6]，需引起关注。与2005年海盐县O139群霍乱弧菌药敏试验结果比较，原来对强力霉素、新霉素敏感的，现出现耐药；原来对复方新诺明、痢特灵耐药又转为敏感。由于药敏监测菌株数量少，不一定具有代表性，尚需要积累更多的数据和资料监测药敏动态变化情况，才能为霍乱弧菌的流行病学研究以及指导临床用药与预防用药提供科学依据。

参考文献

[1] 周晓红, 徐佩华, 陈鸣芳, 等. 一起食源性霍乱暴发疫情的病原学检测[J]. 疾病监测, 2009, 24(7): 514-516.

［2］肖东楼主编. 霍乱防治手册［M]. 第6 版. 北京:人民卫生出版社, 2013:74－114.

[3] Clinical and Laboratory Standardize Institute. 抗微生物药物敏感性试验执行标准 M100[Z].2018,      28th edition:1-257.

[4] 燕勇, 罗建勇, 朱心强, 等. 霍乱及霍乱弧菌检测技术研究进展[J]. 上海预防医学, 2012, 24(8): 459-462.

[5] 周晓红,孙明华 ,徐佩华,等. 从肠道门诊送检标本中检出7株霍乱弧菌[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(12): 1485-1487.

[6] 袁玉起, 胡彬, 毕振旺, 等. 2013 年山东省1 例霍乱O139 群菌株分离鉴定及特征分析[J]. 山东大学学报( 医学版), 2014, 52(2): 97-100.