神经类中药活性成分的非水毛细管电泳法测定

张四军¹ ，张玉林²

（1湖北省洪湖市人民医院，湖北洪湖 433200；2，湖北中医药大学检验学院，430065）

 [摘要] 目的：建立非水毛细管电泳法快速分离测定具有神经功效的两种中药活性成份（葛根素和大豆苷元），并应用于葛根中2种组分的含量测定。方法：采用非水毛细管电泳法，以七叶内酯作为内标，90 mmol/L胆酸钠-3.0 %醋酸-15%乙腈的甲醇液作为缓冲液，熔融石英毛细管柱，分离电压20 kV，检测波长254 nm，柱温25 ℃，压力进样：50 mbar×5 sec。结果：葛根素和大豆苷元在10.00～200 µg·mL^-1与峰面积线性关系良好。精密度分别为1.86%和2.31%：平均回收率分别为96.72%和97.26%。结论：该方法简单、快速、准确、重复性好，可用于葛根的2种组分的含量测定。

关键词：葛根素；大豆苷元；非水毛细管电泳；葛根

Determination of Active Components in Traditional Chinese Medicine by Nonaqueous Capillary Electrophoresis

Zhang sijun¹_，Zhang yulin²

(1,The People's Hospital of Honghu,Hubei Province, 433200;

2, School of Laboratory Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, 430065)

ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a non-aqueous capillary electrophoresis (NCAE) method for the determination of puerarin and daidzein in Puerariae Radix. METHOD Separation was carried out an uncoated fused capillary (50cm ×50μm i.d.) with a running buffer containing 90 mmol/L sodium cholate, 3.0% acetic acid and 15% acetonitrile in methanol. Esculetin was used as internal standard. A separation voltage of 20 kV and UV detector wavelength at 254 nm were adopted. Column temperature was 25℃ and pressure injection was 50 mbar×5 sec. RESULT The calibration ranges were 10.00~200µg·mL^-1 of both analytes. Under the optimum conditions, the RSD of the peak area of analyte were 1.86% and 2.31% , respectively. The average recoveries were 96.72% for puerarin and 97.26% for daidzein in Puerariae Radix, respectively. CONCLUSION The proposed method is simple, rapid, accurate and higher repeatable, and can be used to control of the quality of Puerariae Radix.

KEY WORDS: puerarin; daidzein; NCAE; Puerariae Radix

葛根为豆科植物野葛(Pueraria lobata Willd.Ohwi)或甘葛藤 P.thomsonii Benth.的干燥根，葛根有效成分是葛根素、大豆苷元等多种葛根异黄酮，其中主要的两种活性成分为葛根素（puerarin）和大豆苷元（daidzein）。相关研究报道表明，葛根对多种脑损伤具有神经保护作用、降低兴奋性氨基酸的毒性作用、抑制氧化应激及抑制细胞凋亡等多种作用^[1-2]。目前葛根素已经广泛的应用于多种临床疾病的治疗，特别在中枢神经系统的应用日益受到重视，对帕金森综合征等神经系统疾病的治疗有显著疗效，对局灶性脑缺血诱导的神经细胞损伤有一定的保护作用 ^[3-7]。传统的葛根素和大豆苷元的测定方法主要是高效液相色谱法(HPLC) 、荧光光度法和薄层扫描法，但随着非水毛细管电泳（NACE）的出现，与经典传统的毛细管电泳技术相比较，NACE具很多优点，例如分离效率高、分析对象范围广、吸附少和分离选择性强等，因此应用越来越广泛^[8-11]。本文采用NACE测定两种异黄酮葛根素和大豆苷元在葛根中的含量，是一种高效分离，大大缩短分析时间的新型方法，可以用来快速测定葛根中2种组分的含量。

1.实验仪器与材料

G1600AX高效毛细管电泳仪（美国安捷伦）；电子分析天平（日本岛津）；KQ-100DB数控超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；0.45μm微孔虑膜；未涂层熔融石英毛细管柱75μmID×50 cm，有效长度41.5cm （河北永年光纤厂）。 

甲醇、 胆酸钠、冰醋酸均购于十堰市化学试剂厂；葛根素（含量>98%，中国食品药品检定研究院，批号：110752-201313），大豆苷元（含量>98%，中国食品药品检定研究院，批号：110780-200405），七叶内酯（含量>98%，西安汇林生物科技有限公司，批号：20130301）。

2.方法与结果

2.1电泳条件

未涂层的熔融石英毛细管柱50 μmID×50 cm，有效长度41.5 cm；缓冲液为90 mmol.L^-1胆酸钠-3.0%醋酸-15%乙腈的甲醇溶液；检测波长为254 nm；电压为+20 kV；温度为25℃；进样量50 mbar×5 sec。使用前将缓冲液通过0.45μm过滤器并通过超声波脱气。

2.2 溶液配制

对照品溶液的制备：精密的称定葛根素对照品和大豆苷元对照品各10.0mg，置于10mg容量瓶中，加甲醇溶液充分溶解，稀释至刻度，配制成混合对照品溶液，使葛根素对照品和大豆苷元对照品浓度均为1.00 mg.mL^-1，可以用甲醇将不同浓度的参比溶液稀释至所需浓度。

内标溶液制备：精密称取约10 mg的内标对照品，将其置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使其完全溶解，稀释至刻度。配置七叶内酯溶液浓度为1.0 mg.mL^-1，作为内标贮备液。精密吸取1.0mL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释得100 μg.mL^-1的内标工作液。

供试品溶液制备：取葛根药材适量，粉碎机粉碎，放置干燥箱中，60℃干燥，称取1.0 g葛根药材粉末，甲醇-冰醋酸（100﹕1），超声3次每次15mL，抽滤，滤液转移至50 mL容量瓶中，将体积的甲醇调节定容并通过0.45μm超滤膜过滤并脱气。

2.3线性关系和最低检测限

精密量取葛根素、大豆苷元混合对照品溶液和内标溶液，用甲醇溶液稀释制得一系列对照品溶液，使葛根素和大豆苷元对照品溶液浓度为20，40, 100, 200, 300和400 μg.mL^-1，内标溶液浓度为50 μg.mL^-1，按2.1项下电泳条件进样分析。以葛根素和大豆苷元的浓度X(μg.mL^-1)为横坐标，葛根素和大豆苷元峰面积与内标峰面积之比Y为纵坐标线形回归，葛根素和大豆苷元在10～200 μg.mL^-1下，其线形回归方程分别为Y=0.0207X-0.2382(r =0.9991)；Y=0.0424X -0.3229(r=0.9990)，结果表明其线性关系良好。逐步稀释对照品溶液，检测限(LOD)以3倍的信噪比（S/N）计，葛根素和大豆苷元的LOD值分别为0.4 μg.mL^-1和0.2 μg.mL^-1，代表性的对照品和内标电泳图见图1-A。

2.4精密度试验，稳定性试验和重复性试验

取一定浓度的葛根素（100 µg·mL^-1）和大豆苷元（60 µg·mL^-1）混合对照品溶液和内标溶液（100 µg·mL^-1）各0.5 mL，混匀，混合溶液连续进样6次，用葛根素和大豆苷元峰面积与内标峰面积比和迁移时间的相对标准偏差(RSD)作为考察体系精密度的指标。葛根素和大豆苷元与内标迁移时间之比RSD为0.12%和0.23%，峰面积与内标之比的RSD分别为1.86%和2.31%。 

取供试品溶液分别于0、1、2、4、8h进样，计算葛根素和大豆苷元与内标峰面积之比的RSD分别为2.35%和2.64%，被分析化合物在8h稳定。

按“2.2项”下分别制备供试品溶液5份，按“2.1项下”电泳条件进样，计算葛根素平均含量为7.8 mg·g^-1，其RSD为2.16%，大豆苷元的平均含量为0.9 mg·g^-1，其RSD为1.78%，表明重复性良好。

2.5 回收率试验

精密称取已知含量的葛根细粉0.5g (含葛根素7.8mg·g^-1和大豆苷元0.9 mg·g^-1) 5份，分别加入葛根素对照品4mg，大豆苷元对照品0.5mg和内标0.75mg，按“2.2项”下分别制备供试品溶液5份，并按“2.1”项下电泳条件进样分析，其结果见表1，其回收率高于95%，可以用来葛根素和大豆苷元的测定，符合质量控制条件的要求。

表1 葛根素和大豆苷元的加样回收率

Tab 1 The recovery of puerarin and daidzein

2.6样品的测定

葛根药材，经60℃干燥，粉碎过60目筛，精密称取细粉约1.0g，共3份，加入甲醇-冰醋酸（100﹕1），按“2.2”项下供试品溶液制备条件制备，按“2.1”项下电泳条件进样分析，记录色谱图（1-B）和峰面积，用内标法计算，葛根素和大豆苷元的含量，其含量分别为7.8、8.01、7.7 mg·g^-1和0.9、0.93和0.85mg·g^-1。

图1  A 葛根素和大豆苷元与内标标准电泳图；   B 样品电泳图

（1葛根素；2大豆苷元；3七叶内酯）

 Fig 1 Typical Electropherograms of mixture standard solutions (a) and sample (b)

3讨论与结论

葛根素，大豆苷元和内标七叶内酯均属于酚羟基异黄酮类化合物，具有相似的理化性质，具有酚羟基可以形成负电荷化合物，因而适合毛细管电泳测定，实验中考察了不同浓度胆酸钠（60～110 mmol·L^-1）对非水毛细管电泳分离条件的影响，实验结果表明，葛根素，大豆苷元和内标的迁移时间（t_R）随胆酸钠浓度的增加而延长，它们的分离度（R）也随胆酸钠浓度的增加而变大，实验中当胆酸钠的浓度小于80 mmol·L^-1时，被分析物葛根素与杂质达不到基线分离，因此，实验中选择了90 mmol·L^-1胆酸钠为运行电解质。我们同时还考察了不同浓度醋酸（0～5.0%）对葛根素，大豆苷元和内标分离的影响，葛根素，大豆苷元和内标的迁移时间随醋酸体积分数的升高而缩短，当醋酸为3.0%时, 被分析化合物的检测灵敏度最高，为了提高检测灵敏度，实验中选择醋酸体积分数为3.0%，最后，我们还考察了5 %～20%乙腈对分离的影响，实验中选择的最佳乙腈体积分数为15%。终上所述，选择了缓冲液为90 mmol·L^-1胆酸钠-3.0%醋酸-15%乙腈的甲醇液。

本实验利用NCAE分离效率高、分析速度快等特点，建立了一种快速NACE测定葛根中葛根素和大豆苷元的含量的方法，相比较HPLC相比较，其分析时间段，试剂用量小，对环境污染小，该方法取得了较好的线性关系、精密度、重现性、回收率良好，是控制葛根中葛根素和大豆苷元的一种较好的分析方法，而且为以后毛细管电泳与质谱的联用奠定了理论基础，提供了技术支持。

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