水下爆炸致兔心肌损伤时同型半胱氨酸浓度变化及药物干预效果的研究

南京大学南京总医院 解放军第123医院 张扬 宫剑滨 叶长青 张强

【摘要】目的：旨在研究水下条件动物爆炸伤的发生机制，以及药物干预条件下的正性变化，为水下条件火器伤的救治提供临床理论基础。方法： 将60只新西兰兔随机分为正常对照组（Normal group）（n=10）、损伤组（Injury group）（n=10）、药物治疗实验组（n=40）；药物治疗实验组再根据乌司他丁（urinastatin、UTI）和血必净用药剂量的高低分为A组：UTI低剂量组（2.5万单位/kg，n=10），B组：UTI高剂量组（ 10万单位/kg，n=10），C组：血必净低剂量组（5ml/kg, n=10），D组：血必净高剂量组（50ml/kg, n=10）。使用中国科技大学爆炸实验室研制的爆炸装置，参照相关爆炸实验数据，以保证实验兔伤后24小时存活为标准，设定合理的爆炸当量。实验中记录实验兔的心率、呼吸、监测血气及心肌干湿重比（W/D），同型半胱氨酸（Hcy）、肌酸激酶（CK）肌酸激酶同工酶（CK-MB）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)浓度，观察心肌组织病理形态学。SPSS22.0单因素方差分析（One way ANOVA）和 LSD 进行组间比较，P < 0.05被视为有统计学差异。结果：①UE致心肌损伤时血Hcy浓度升高，损伤组Hcy的升高与正常对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；②UTI干预组Hcy的浓度下降与损伤组比较，存在统计学差异（P < 0.05）；③高浓度UTI干预组疗效优于低浓度干预组；④血必净干预组无论低浓度和高浓度均未发现Hcy浓度变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；结论：UE致心肌细胞水肿时血Hcy浓度显著升高，伤后4小时即可监测到浓度变化，12小时达高峰，24小时回落至伤后4小时水平，同期未监测到其他炎症细胞因子的浓度发生变化，考虑Hcy可能是急性心肌损伤后早期较为敏感的炎性指标，高浓度UTI可明显降低UE致心肌细胞水肿期血Hcy水平，可能与UTI抑制炎症细胞因子的作用有关。

【关键词】 水下爆炸；心肌损伤；同型半胱氨酸；药物干预效果

Changes of homocysteine concentration and effect of drug intervention in rabbits with myocardial injury induced by underwater explosion

Zhang Yang, Gong Jianbin and Ye Changqing Zhang Qiang, 123rd Hospital of PLA, Nanjing general hospital, Nanjing University

[Abstract] Objective: To study the mechanism of underwater explosive injury in animals and the positive changes under the condition of drug intervention. Methods: 60 New Zealand rabbits were randomly divided into normal control group (n = 10), injury group (n = 10) and drug treatment group (n = 40). The drug treatment group was further divided into group A according to the dosage of urinastatin, UTI and Xuebijing: low dose UTI group (25,000). Unit / kg, n = 10), group B: UTI high dose group (100,000 units / kg, n = 10), group C: Xuebijing low dose group (5 ml / kg, n = 10), group D: Xuebijing high dose group (50 ml / kg, n = 10). Using the explosive device developed by the Explosion Laboratory of China University of Science and Technology and referring to the relevant explosive experimental data, a reasonable explosive equivalent was set to ensure the survival of rabbits 24 hours after injury. Heart rate, respiration, blood gas and myocardial dry-wet weight ratio (W/D), homocysteine (Hcy), creatine kinase (CK-MB), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydrogenase (LDH) and alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase (alpha-HBDH) were recorded and observed in the myocardial group. Pathological morphology. SPSS22.0 One way ANOVA and LSD were compared between groups and P < 0.05 was considered to be statistically significant. Results: There were significant differences in the concentration of Hcy between the injured group and the normal control group (P < 0.05). There were significant differences in the concentration of Hcy between the UTI intervention group and the injured group (P < 0.05). No significant difference was found in the concentration of Hcy between low and high concentrations in the intervention group (P > 0.05). Conclusion: The concentration of Hcy in the blood increased significantly in myocardial edema induced by UE. The concentration change could be monitored 4 hours after injury, reached a peak at 12 hours, and returned to the level of 4 hours after injury at 24 hours, and was not monitored at the same time. Considering that Hcy may be a sensitive inflammatory marker in the early stage of acute myocardial injury, high concentration of UTI can significantly reduce the level of Hcy in the myocardial edema induced by UE, which may be related to the inhibition of inflammatory cytokines by UTI.

[keyword] underwater explosion; myocardial injury; homocysteine; drug intervention effect

前言

水下爆炸伤（underwater explosion injury，UEI）是指水下爆炸产生的冲击波导致的机体损伤。水下爆炸可分为三个阶段：爆原爆轰、冲击波的形成和传播、二次压力脉冲的形成与传播。1、爆原爆轰即炸药发生爆炸，在产生高温高压的爆炸产物的同时释放出大量能量，能量以辐射方式向外扩散，爆原周围的水在高温下迅速汽化而形成高温高压的蒸气球。温度高达3000℃，压力为50000Kgf/cm2；2、冲击波的形成和传播，爆炸产生的能量中约50%转化为冲击波向外传播，对人体产生极大的杀伤作用的，在向外传播过程中,冲击波的振幅减小,波形变宽，最后衰减为声波。3、二次压力脉冲的形成与传播，高温高压的蒸气球持续膨胀，同时在水的浮力作用下不断上浮，此过程中，水压和气球内压不断下降，在某一时刻两者达到平衡，气球停止膨胀，气球在水的反作用力下开始收缩，球内压力再次上升，同时向水中辐射持续时间更长的低波幅压力波，称为二次压力脉冲，二次压力脉冲对人体组织，尤其是薄壳结构（例如肺组织）也可以产生较大的破坏作用。UEI最早于第二次世界大战期间英德两国对其临床和病理进行研究，近一个世纪，仅有少数几个国家进行此类研究，且研究成果多数保密，着眼于未来战争，我们有必要研究水下条件动物爆炸伤的病理生理机制，以及药物干预的效果，为水下爆炸伤的临床救治提供理论基础。

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)，是体内甲硫氨酸(methionine,Met)代谢的中间产物，Met在腺苷转移酶作用下生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM），SAM在甲基转移酶作用下脱甲基生成S-腺苷半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），SAH由腺苷高半胱氨酸酶脱去腺苷和1分子水后生成Hcy，Hcy在体内主要以氧化、还原和二硫化物混合型等形式存在，其中70%-80%与蛋白结合，其余大部分为二硫化物混合型，还原型仅占约1%［1、2］，所有统称为总同型半胱氨酸(tHcy)。在体内，约50%的Hcy 和甲基四氢叶酸在甲硫氨酸合成酶(methionine synthase reductase,MSR)的作用下，合成甲硫氨酸和四氢叶酸，其余约50% 的Hcy与丝氨酸在胱硫醚β合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)作用下形成胱硫醚，一部分胱硫醚裂解成半胱氨酸和a-酮丁酸，此过程需要胱硫醚裂解酶的参与，a-酮丁酸在a酮酸脱氢酶作用下生成丙酰辅酶A，另一部分则生成丝氨酸，遗传和环境营养两方面因素可影响血Hcy的浓度，编码Hcy代谢关键酶基因的突变为主要遗传因素，如亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、CBS、胱硫醚γ裂解酶（CSE）、次甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)等，而环境营养因素包括药物、不良生活习惯、某些疾病和代谢辅助因子的缺乏，1969 年美国哈佛大学病理学家Mccully偶然发现一名死于动脉粥样硬化的8岁男孩患有遗传性同型半胱氨酸尿症, 由此提出了高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy）可能诱发动脉粥样硬化的假说，但当时未被医学界所接受，直到1976年经过大规模流行病学调查证实后Hcy才被确立为心血管疾病的独立危险因子。1995年第一届Hcy国际学术会议召开标志着Hcy理论正式为医学界认可，目前研究发现，Hcy可通过干扰血管内皮细胞一氧化氮的代谢而对其产生明显的毒害作用，Hcy代谢过程中产生的大量活性氧中间产物，如超氧化物、过氧化物、羟基等都可以对血管内皮细胞NO的生成起到抑制作用，并降低其生物学活性，促进其降解，同时Hcy可激活血管内氧化应激反应，促进脂质过氧化物的生成，从而对血管内皮细胞产生直接毒性作用，大量的过氧化物也可抑制谷胱甘肽还原酶的活性，降低其抑制NO氧化失活的作用[2,3，4]。Hcy对血管内皮细胞的基因表达具有选择性，在内皮细胞完整时可通过改变基因表达抑制细胞内DNA的合成，从而促进细胞凋亡，而在内皮细胞受损时，Hcy可诱导受损组织处内皮细胞的原癌基因c-fos和c-jun mRNA表达上调，促进活性蛋白-1的生成，进而激活细胞核DNA和核蛋白的合成，经过一系列的转录和翻译过程，最终导致局部血管平滑肌细胞增殖和组织胶原增生。此过程中还伴随产生单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子(VEGF)等相关细胞因子，协同促进细胞增殖，并趋化单核细胞聚集，刺激白细胞介素-6（IL-6）的分泌，进而激活内核转录因子kB（NF-kB），共同促进新生血管内皮细胞和胶原的过度增生[3]。Hcy对蛋白激酶及相关因子的活性也具有双重性，一方面可激活丝裂霉素激酶、蛋白激酶c，促进线粒体细胞色素c的释放和Ca2+的内流，另一方面可抑制蛋白激酶A、凝血酶调节蛋白、二磷酸腺苷(ADP)酶、纤溶酶原激活物(t-PA)的活性，从而减少凝血酶和凝血因子Ⅴa、Ⅷa的灭活，激活凝血因子Ⅴ，Ⅻ的活性，并抑制纤溶酶的活性，破坏凝血和纤溶之间的平衡，使血液处于高凝状态，两方面共同作用的结果是血管壁组织增生、管腔狭窄、血栓形成[2,3,4]。Hcy可促进甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）的合成，其中间代谢产物活性氧自由基和过氧化物可对LDL进行氧化修饰，氧化LDL对血管内皮细胞有直接损伤作用，并促进吞噬细胞聚集，使血管内膜增厚、脂质沉积，促进动脉粥样硬化的形成。动脉粥样硬化的过程中，Hcy诱发中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞趋化、聚集，促进IL-8、VEGF、IL-6、表皮黏附因子、过氧化物的释放对病变的发生、发展起到至关重要的作用[3,5]。高水平的HCY与心脏、脑血管和外周血管粥样硬化病变有关，与阿尔茨海默病、肾功能衰竭、糖尿病的早期死亡和流产有关。HHcy现已成为一个重要的独立的心血管疾病（尤其是动脉粥样硬化）危险因素。

一、对象与方法

1.1 实验材料 实验动物为60只健康新西兰兔，雌雄各半，质量（1.84±0.29）kg，由安徽长临河医药科技有限公司提供（许可证号syxk(皖)2007-002）。乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司， 批号：031505264）；血必净（天津红日药业股份有限公司，批号：1509161）；同型半胱氨酸（Hcy）测定试剂盒（酶循环法）（北京世纪沃德生物科技有限公司，批号：F13810101）；肌酸激酶(CK)检测试剂盒(N-乙酰半胱氨酸法）（宁波美康生物科技有限公司，批号：17081807）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒(免疫抑制法)（宁波美康生物科技有限公司，批号：17083004）；天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(AST)（速率法）（北京万泰德瑞诊断技术有限公司，批号：GG7104B）；乳酸脱氢酶测定试剂盒(LDH)（L-P速率法）（北京万泰德瑞诊断技术有限公司，批号：XJ8101A）；α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒(α-HBDH)（速率法）（北京万泰德瑞诊断技术有限公司，批号：XJ7104A）；血气分析采用美艾利尔Epoc®血气分析系统。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组  将60只新西兰兔随机分为正常对照组（Normal group）（n=10）、损伤组（Injury group）（n=10）、药物治疗实验组（n=40）；药物治疗实验组再根据UTI和血必净用药剂量的高低分为A组：UTI低剂量组（2.5万单位/kg，n=10），B组：UTI高剂量组（ 10万单位/kg，n=10），C组：血必净低剂量组（5ml/kg, n=10），D组：血必净高剂量组（50ml/kg, n=10）。

1.2.2 模型建立  使用中国科学技术大学研制的爆炸装置，并按照爆炸力学相关公式及心肌组织病理观察结果设定合理爆炸剂量、距离。具体做法是：将兔固定于实验装置平台上，暴露心前区，其余部位由自行设计的保护装置进行防护，记录实验兔的心率、呼吸频率，测血氧分压及心肌干湿重比（W/D），观察心肌组织病理形态学。

1.2.3 标本采集 硫喷妥钠8mg/kg经静脉注射麻醉实验兔，分别经左颈内动脉和右颈外静脉放置留置针，各组分别采集伤前0小时，伤后4小时，伤后12小时，伤后24小时的颈内动脉血行血气分析，并采集以上时间点颈外静脉血4℃离心，分离血清备用。伤后24小时常规处死实验兔，心脏分为三段，分别为心尖（留做病理标本），心中部（留做干湿比），心底部（留做匀浆）。

1.3 观察指标

1.3.1 心肌组织病理组织学观察  取心尖组织10%甲醛固定，石蜡包埋，切片4-5μM厚，HE染色，光镜下由两名有经验的病理医生分别独立观察。

1.3.2 W/D  取心中部，吸干表面杂质，天平称重后，置于80℃烘箱烘72h至烘干，称取干重，计算W/D。

1.3.3 动脉血气分析  取颈内动脉血2ml，即刻行血气分析。

1.3.4 细胞因子、心肌酶、同型半胱氨酸浓度测定 颈外静脉血离心取血清，分别测定CK、CK-MB、AST、LDH、α-HBDH、Hcy的浓度。

1.4 统计学方法SPSS22.0单因素方差分析（One way ANOVA）和 LSD 进行组间比较，P < 0.05被视为有统计学差异。

二、结果

2.1各组实验数据分析：

 ①爆炸前后兔CK、CK-MB、AST、LDH、α-HBDH水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，但爆炸伤后24小时兔心尖部组织病理均见细胞水肿、血管高度扩张、充盈（I、A、B、C、D组），部分见灶状坏死（I、A、C、D组），见图（1-5）。

表1 爆炸伤前后心肌酶浓度值（`X±S）（IU/L）

注：N代表正常组，I代表损伤组，相应时间节点各组比较P＞0.05。

图1HE ： ×400心肌空泡变性

图2、3HE ： ×400血管高度扩张、充盈

图4HE ： ×400心肌见灶状中性白细胞浸润

图5HE：×400心肌空泡变性及灶状变性坏死

②UE致兔心肌细胞水肿，血Hcy浓度升高，损伤组与正常对照组比较，差异存在统计学意义（P<0.05），③低浓度UTI干预组伤后4小时血Hcy浓度与损伤组比较存在统计学差异（P<0.05），与正常组比较无统计学差异（P>0.05）；④高浓度UTI干预组伤后4小时、12小时、24小时血Hcy浓度与损伤组比较存在统计学差异（P<0.05），与正常组比较无统计学差异（P>0.05）；⑤低浓度和高浓度血必净干预组伤后Hcy浓度与损伤组比较无统计学差异（P>0.05），与正常组比较存在统计学差异（P<0.05），见表2。

表2 各组血Hcy浓度值（`X±S）（umol/L）

注：N代表正常组，I代表损伤组，A代表UTI低剂量(2.5万/kg)组，B代表UTI高剂量（10万/kg）组，C代表血必净低剂量(5ml/kg)组，D代表血必净高剂量(50ml/kg)组。

⑥伤后血Hcy浓度于4小时升高，12小时达高峰，24小时明显下降，见表3。

三、讨论

UTI是正常人体组织分泌的由143个氨基酸组成糖蛋白，具有两个含糖链的Kunitz 结构功能区，对机体正常生理代谢所产生的消化酶、纤溶酶、髓过氧化物酶、透明质酸酶等多系统蛋白酶发挥广泛的调控作用，抑制蛋白酶的过度激活，人体产生的UTI从肾脏排泄，因而临床使用的UTI注射液系从健康人尿液中提取，目前对UTI的临床药理作用研究发现其对细胞代谢所产生的生物活性物质，如过氧化物、阴离子自由基、内毒素等具有清除作用，可减轻缺血再灌注时血管内皮细胞的损伤，对细胞和溶酶体磷脂膜具有保护作用，可抑制刺激因素所导致的溶酶体水解酶的过度释放，UTI能抑制激肽系统的激活，减轻心肌抑制因子等多种毒性多肽的生成，UTI能促进血小板代谢，改善血小板的功能，同时又可以抑制凝血因子的合成和释放，对内源性凝血机制具有双向作用，UTI可抑制炎症机制，减少IL-6，IL-8，TNF-a等炎症因子的释放，从而减轻炎症反应对重要脏器的损伤[10,11]，正常情况下，人体UTI含量较低，手术、创伤、休克、感染等应激状态时机体可产生大量的UTI，以保护心、脑、肝、肾等重要脏器[10,11]；1985年，日本最早将UTI应用于临床治疗急性胰腺炎，取得令人满意的疗效，此后广泛应用于重症感染、多脏器功能衰竭等疾病的治疗，近来研究发现UTI对体外循环手术、炎性肠梗阻、胃癌、结直肠癌、肝切除术后[12、13]、自体血回收、 高血压脑出血、创伤性颅脑损伤[14、15]等也有明显的治疗效果。

血必净为纯中药制剂，系红花、赤芍、川芎、丹参、当归的提取液，包含多种生物活性成分，具有化瘀解毒的作用，其药理作用主要通过拮抗内毒素，阻断内毒素所致的TNF-α释放，激活网状内皮系统（RES），增强其吞噬和廓清功能，促进肝脏合成超氧化物歧化酶SOD，增强机体清除氧自由基能力，改善动脉血压，抑制感染性休克的趋势；可降低机体损伤时血清AST、磷酸肌酸激酶（CPK）、LDH、丙二醛（MDA）的水平；能改善血小板的功能与数量，增加纤维蛋白原含量，促进血小板聚集，从而缩短血浆凝血酶时间（TT）和凝血酶原时间（PT），同时降低血浆血栓素B2（TXB2）水平，改善DIC时异常的凝血机能。

目前多数研究认为HHcy与遗传因素、营养状况、肾功能衰竭、药物、恶性肿瘤、内分泌和免疫系统疾病、生活方式有关。创伤、应激等急性致病因素与HHcy相关研究甚少，本实验发现UEI致心肌细胞水肿时可出现血Hcy浓度升高，且灵敏度高于其他炎症细胞因子，高浓度的Hcy可导致心血管细胞离子通道失衡，研究显示Hcy可显著增加心房肌细胞钠电流，显著抑制心房肌细胞的瞬时外向钾通道电流、超快延迟整流钾通道电流及内向整流钾通道电流，对肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流也具有明显抑制和损伤作用[16]。实验还发现高浓度UTI可降低伤后Hcy水平，此作用可能与UTI抑制炎症的机制有关，但具体生理机制仍不明确。

四、小结

以往认为Hcy作为炎症因子对血管壁粥样硬化的形成产生慢性作用，本实验发现细胞急性损伤水肿时血Hcy浓度出现显著升高，伤后4小时即可监测到浓度变化，12小时达高峰，24小时回落至伤后4小时水平，提示Hcy可能是细胞急性损伤早期炎症反应因子之一，高浓度UTI可明显降低UE致心肌细胞水肿期血Hcy水平，此作用可能与UTI稳定细胞磷脂膜的机制有关，且病理切片中仅高浓度UTI组未发现灶状坏死，也进一步佐证UTI对细胞的保护作用，但样本数过少，无法做出统计学判断。

本实验的局限性在于不能完全隔离邻近脏器受到爆炸的冲击，可能会对实验数据产生干扰；实验采用爆炸当量较低，心肌细胞的损伤具有可逆性，且观察时间较短，对药物治疗效果和预后的改善还不能明确。

参考文献

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