骨折合并脑外伤大鼠血清对大鼠单纯骨折的放射学及组织形态学影响

杨博元¹马勇¹ 郭杨¹ 朱亚亮^*2黄浩² 朱爱洪²方莹²

（¹南京中医药大学骨伤研究所，南京，210023； ² 常州市金坛区中医医院 ，常州，213200 ）

摘要  目的：通过单纯股骨骨折大鼠肌注骨折合并脑外伤大鼠血清后的放射学及组织形态学分析，为“促骨折愈合血清”临床应用奠定理论基础。 方法： 制备骨折合并脑外伤模型SD大鼠20 只,分期制备治疗血清，分别保存于瓶中，标记，随机取20 只健康大鼠制备阴性对照血清，分别冻干处理 ；所有大鼠均经腹主动脉采血制备血清。 制备股骨干骨折模型大鼠 96 只 ，将模鼠随机分成 3 组， 即治疗组（A组）、 阴性对照组（B组）和空白对照组（C组）， 每组 32 只，  治疗组在术后相应时间分别臀肌内注射对应时段实验血清， 阴性对照组肌注阴性对照血清， 空白对照组不做处理； 每组于术后第1 w、2 w、3 w、4 w各处死8只大鼠，通过放射学的X 线观察、双能X线骨密度检测及组织形态学观察，分别对比各组同期骨修复与重建情况。 结果：术后各组同期X线对比发现A组骨修复与重建进程较B、C组明显加快。术后2 w，A组骨痂体积明显大于B、C组，差异具统计学意义。术后  3 w，A组与B、C组对比无明显统计学差异。术后 4 w , A组骨痂体积缩小，B、C组骨痂体积进一步增大；A组与B、C组对比具有统计学差异。A组骨密度均高于同期B、C组，且差异具有统计学意义。骨形态学发现A组较B、C组更早形成骨痂，更早出现板层骨。 结论 ：脑外伤合并骨折大鼠的血清对骨修复与重建有明显的促进作用。

【关键词 】脑外伤 ； 骨折愈合 ；骨形态学；血清；骨密度

The radiological and histological changes of  fractures of rats with traumatic brain injury on simple fracture in rats

Abstract  Objective: Through radiological and histomorphometric analysis of the serum of the femur-injected fracture combined with traumatic brain injury in rats with femur fractures, it lays a theoretical foundation for the clinical application of “promoting serum for fracture healing”.Methods: Twenty Sprague-Dawley (SD) rats with traumatic brain injury were prepared and treated serum was prepared in different stages. The serum was kept in the vials and labeled. Twenty healthy rats were randomly selected to prepare negative control serum and freeze-dried respectively; all rats passed through the abdominal aorta. Blood was collected to prepare serum. Ninety-six femoral shaft fracture model rats were prepared and the model rats were randomly divided into three groups: treatment group (A group), negative control group (B group) and blank control group (C group), 32 rats in each group. At the corresponding time after the operation, the gluteal muscles were injected with the corresponding period of experimental serum, the negative control group was injected with the negative control serum, and the blank control group was not treated; each group was sacrificed at the 1st, 2nd, 3rd, and 4th weeks after operation. Only rats were compared with radiological X-ray observation, dual-energy X-ray bone density detection and histomorphological observation of bone repair and reconstruction in each group at the same time.RESULTS: After X-ray contrast in all groups during the same period, it was found that the process of bone repair and reconstruction in group A was significantly faster than that in group B and C. After 2 weeks, the volume of callus in group A was significantly larger than that in group B and C. The difference was statistically significant. At 3 w after surgery, there was no significant difference between group A and group B and C. After 4 weeks, the volume of callus in group A was reduced, and the volume of callus in group B and C was further increased. The difference between group A and group B and C was statistically significant. The bone mineral density in group A was higher than that in group B and C at the same time after operation, and the difference was statistically significant. Bone morphology found that group A earlier than group B and group C formed osteophyte and earlier appeared lamellar bone. Conclusion: The serum of intramuscular injection combined with traumatic brain injury can promote the formation of fractured osteophyte and accelerate the reconstruction of osteophyte.

【Key words】 Brain trauma; Fracture healing; Bone morphology; Serum; Bone minerall density   

骨折是骨科最常见的疾病，如何加速骨折愈合、治疗骨折迟缓愈合及不愈合是骨科临床一直关注和研究的话题，目前虽然有很多促进骨折愈合的制剂，但大都效果不佳。临床和实验均发现合并脑外伤后，骨的修复与重建加速。本文在大鼠单纯股骨骨折模型中肌注骨折合并脑外伤模鼠血清，模拟颅脑损伤骨折的体内环境， 通过放射学及组织形态学观察骨的修复与重建过程，旨在为“促骨折愈合血清”临床应用提供理论依据。

1材料和方法

1．1 实验动物及分组

14周龄136只雄性SD大鼠[许可证号：SCXK(京)206-0011]， 体重 （310 ± 29） g。实验过程南京中医药大学动物中心提供、饲养，动物房12小时明暗交替，分笼饲养，期间随意获得食物和水， 定期紫外线消毒与排风。  南京中医药大学动物伦理委员后会审批通过。20只大鼠制造骨折合并脑外伤模型，并制备实验血清；20只正常大鼠制备阴性对照血清。余96只大鼠随机分为实验组、阴性对照组、空白组，每组32只。

1.2主要仪器及试剂：X线摄像系统（GE 美国），数字化双能X线骨密度仪（MEDILINK 法国)  ，HE染色试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）Image Pro Plus6.0图像分析系统（Media Cybernetics 美国)

1.3 大鼠股骨骨折及骨折合并脑外伤模型的制作

1.3.1 大鼠股骨干骨折模型的制作   改良的Einhorn 大鼠闭合股骨骨折模型^【1】：大鼠经用用2.5％戊巴比妥钠（60mg/kg）将实验动物经腹腔注射麻醉后，仰卧位，常规备皮、消毒、铺巾，膝关节伸直位，沿髌骨内侧缘取长约1.5Cm切口，并沿髌骨内侧缘切开关节囊，使髌骨向外侧脱位，然后曲屈膝关节，暴露出股骨髁间凹，从股骨髁间凹处，以直径1 mm 克氏针作逆行克氏针髓内固定，以直血管钳沿骨膜向上钝性剥离大腿肌肉，暴露股骨中段，以超薄砂轮片切割部分股骨，然后沿此薄弱处徒手扳断股骨，生理盐水、双氧水反复冲洗切口，最后伸直膝关节，复位髌骨，逐层缝合切口。

1.3.2 骨折合并脑外伤模型的制作   参照 MArmArou 法^[2 ]及改良的股骨骨折模型制备大鼠骨折合并脑外伤模型20只。 用2.5％戊巴比妥钠（60mg/kg）将实验大鼠经腹腔注射麻醉后，俯卧位将大鼠头部固定于解剖板上，常规备皮、消毒、铺巾，沿大鼠头正中切开头皮，剥离骨膜，暴露左侧顶骨，于冠状缝后1.5 mm、矢状缝旁2.5 mm处，使用直径5mm空心钻头，钻一直径约5mm圆形骨窗，注意不要全部钻穿，保留少许骨质连接，然后用镊子轻轻翘起，并移去骨瓣，暴露大脑皮层，操作时切勿损伤硬脑膜。固定大鼠头部，在硬脑膜上放置一与骨孔大小吻合的2mm厚的垫片，用20g砝码于30Cm高处沿外周导管坠落，直接撞击垫片进行一次打击（撞击能量为600g.Cm），造成左侧大脑皮层挫裂伤。打击后用双氧水、生理盐水反复冲洗伤口。硬膜外置明胶海绵止血，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。麻醉清醒后放回笼中。术后第二天清晨，按照改良的股骨骨折模型型行右股骨骨折髓内克氏针固定。

1.3.3 纳入及剔除标准：脑外伤模型当大鼠造模清醒后（术后2-3h）。按ZeA  LongA神经功能缺损评分^[3 ]：0分 无神经损伤症状；1分 提尾时右侧前爪曲屈且不能完全伸张；2分  自发行走时同时向偏瘫侧转圈；3分 行走时向患侧倾倒；4分 不能自发行走，意识丧失。若小于1分或己死亡的动物被剔除；大于等于1分视为颅脑损伤造模成功。股骨干骨折模型于术后立即进行X线片照射，确定克氏针位于髓内，骨折为横断或短斜型骨折，剔除克氏针穿出骨髓腔、长斜型、粉碎型骨折及死亡的动物。随机补充剔除标本，保证最终纳入分析的动物数量。

1.4 标木采集与处理  于术后第2、5、 8、12、 15、19、22、26天分别取骨折合并脑外伤大鼠4 、4、 3、 3 、2 、2、 1、 1只，收集腹主动脉血，室温静置2-3h,4℃离心（1500r/min ）6min，制备不同时段实验血清，分别标记、保存，冻干处理;20只健康大鼠制备阴性对照血清。A组在术后第2、5、 8、12 、 15、19 、 22、26 天分别臀肌内注射相应时间实验血清。B组对应时间肌注阴性对照血清，C组不予任何处理;每组术后第1 w 、 2 w 、 3 w 、 4 w各处死8只大鼠，采集三组骨折的股骨标本，进行X线检查，观察各组同期骨折线及骨痂形成情况；骨密度仪测定骨折端骨密度，观察各组同期骨密度变化情况；通过HE染色，观察骨折端骨组织形态学变化。

1.5  统计学方法：统计分析所有资料采用SPSS22.0统计软件进行分析处理，计量资料采用均数±标准差（`×±s）表示。组间比较应用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

1．2 方法

2 结果

2.1放射学观察

2.1.1 骨折端X线对比

图1. A组1-4周放射学X线表现

图2. B组1-4周放射学X线表现

图3. C组1-4周放射学X线表现

术后1 w各组均未见明显骨痂形成 ，各组骨折线均清晰。术后2 w，A组骨折线稍微模糊，B、C组骨折线尚清晰。术后  3 w，B、C组骨折线略模糊，A组骨折线进一步模糊。术后 4 w， B、C组骨折线模糊，A组骨折线基本消失。

2.1.2   骨折端骨痂体积比较

表1.  各组术后2 、3、4周骨痂体积的比较（mm³）

术后2 w，A组骨痂体积较B、C组明显大，差异具统计学意义(P＜0.05)。术后  3 w，三组间骨痂体积对比大致相仿，无明显统计学差异(P＞0.05)。术后 4 w , A组骨痂体积进一步缩小，B、C组骨痂体积较前均增大且明显大于A组，并具有统计学差异(P＜0.05)。

2.1.3  骨折端骨密度比较

表2.术后各组1 w、2 w、3 w、4 w骨密度BMD值(mg/cm³)

注：术后1周，各组骨折端骨密度比较无明显统计学差异。术后第2、3、4周，同期A组跟B、C组比较均明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2骨折端组织形态

图4. 各组术后第2周骨形态学(20x)表现

图5. 各组术后第3周骨形态学(20x)表现

图6. 各组术后第4周骨形态学(20x)表现

骨组织形态学观察：术后第2周,A组骨折处见软骨骨痂及钙化骨痂，骨小梁排列无明显规律。而同期B、C组骨痂生长稀疏，已形成典型的骨小梁结构，骨折端可见大量的软骨骨痂,，可见肥大的软骨细胞。术后第3周。A组骨折处有大量硬骨痂生长，骨小梁增多，排列规律，已形成明显的板层骨结构。而同期B、C组大量不成熟的编织骨，骨小梁增多，排列渐趋规律。术后第4周。A组外骨痂基本改建成板层骨，可见有少许软骨存在于外骨痂中。而同期B、C组骨折端编织骨与板层骨融合，骨小梁增粗。

3：讨论

大量临床观察及实验研究均证实合并脑外伤时骨修复与重建加速。1960年GiBson^【4】首次报道颅脑损伤患者，骨折端早期大量骨痂形成；Kim^【5】等发现大鼠单纯股骨骨折愈合时间平均为4周，而合并脑外伤骨折愈合时间比单纯股骨骨折愈合时间平均缩短2周。之后许多学者对这一现象进行了研究。

目前普遍认为这种骨修复与重建的加速是骨形态发生蛋白^【6】、神经生长因子^【7】、胰岛素样生长因子^【7、8】、血小板衍化生长因子^【9】血管内皮生长因子^【10】等多因子参与的复杂过程， 其中任何一种因子都不能完全解释这一现象，因此，对包含众多因子血清的研究显得更有实际意义，本课题采用包含众多因子的血清作为干扰因素，研究发现：x线发现A组骨折骨折愈合速度比B、C组明显加快。A组骨痂体积在2-3周之间最大，之后逐步缩小，说明在第2-3周的某个时间点，A组已经处于骨痂塑形期，根据Wolf定律，破骨细胞对大量无效骨痂进行吸收，所以后期骨痂体积缩小。B、C组，骨痂体积随时间推移逐步增大。同期A组骨密度明显高于B、C组，差异具有统计学意义。骨组织形态学定性观察发现，术后第2周，A组出现大量软、硬骨痂生长，骨折端无明显血肿，而B、C组骨痂稀疏，说明骨折合并脑外伤血清在骨折愈合早期能促进骨折处血肿机化吸收及软骨钙化、骨痂形成。术后第3周，A组外骨痂基本改建成板层骨，进入骨痂塑形期，骨痂量减少；B、C组说明骨折合并脑外伤血清能促进骨痂的改建，促进板层骨的提早出现。

合并脑外伤后骨的修复与重建会加速，本研究肌注脑外伤合并骨折大鼠血清可以最大程度的模拟其体内微环境，能够早期促进骨痂形成，大大缩短骨修复与重建时间，为“促骨折愈合血清“应用临床奠定理论基础。

        实验的结果却受到许多偏倚因素的影响，例如不同固定方式影响骨的修复与重建，我们选择了切开克氏针髓内固定；选取同种大鼠的血清，而非兔子、狗等异种动物，排除了物种因素的影响；选取周龄相同的大鼠，排除了年龄因素对实验结果的影响，这些也在某种程度上排了一些偏倚因素的影响。

我们虽然观察到骨折合并脑外伤的血清可以促进骨的修复与重建，但其具体作用机制尚不明确。下一步的研究方向可能是利用蛋白组学技术筛选出该血清的特异性蛋白，并对这几种蛋白的信号通路进行研究，并最终确定合并脑外伤的骨折愈合加速的机制，最终到达可以人工干预骨折愈合速度的目的。

参考文献

[1]Bonnarens F, Einhorn T A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone[J]. Journal of  Orthopaedic Research Official Publication of the Orthopaedic Research Society, 1984, 2(1):97-101.

[2]Foda M A, Marmarou A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.[J]. Journal of Neurosurgery, 1994, 80(2):291-300.

[3]Longa E R,Weinstein P R,CarlsonS,et al.Reversible midde cerebral arteryocclusion without craniectomy  in rats［J］.stroke，1989，2 0（1）：84-91.

[4]Gibson J M C. Multiple injuries: management of the patient with a fractured femur and a head injury[J]. Bone & Joint Journal, 1960, 42-B(3).

[5]Kim K H, Kim H S, Moon S H, et al. Animal Model and Gene Expression Analysis During the Accelerated Fracture Healing in Traumatic Brain Injury[J]. 2003.

[6]Guo Q, Zhang L. [Effect of brain injury on expression of bone morphogenetic protein 2 in fracture healing process].[J]. Chinese Journal of Reparative & Reconstructive Surgery, 2007, 21(10):1040.

[8]田宝鹏, 陈雯辉, 潘海涛,等. 脑外伤后胰岛素样生长因子-Ⅰ及血小板衍生生长因子对骨折愈合的影响[J]. 首都医科大学学报, 2008, 29(1):69-73.

[9]杨海, 董金波, 王维山,等. PDGF-BB在脑外伤合并骨折患者血液中的表达及临床意义[J]. 系统医学, 2016, 1(11):7-10.[10]岳春彦. 长骨骨折患者合并脊髓损伤对骨折愈合和血清血小板衍生因子、血管内皮生长因子含量的影响[J]. 中国医学工程, 2018(3).